幽門螺桿菌BabA2-UreI融合基因減毒傷寒沙門氏菌重組活載體疫苗的構建與鑒定.pdf

1、背景與目的：幽門螺桿菌(Helicobactcr pylori，Hp)的高感染率及其嚴重的危害性，使Hp疫苗成為當今研究的熱點之一。隨著疫苗研究的深入，應用混合抗原成分制備Hp疫苗將是未來Hp疫苗研究的趨勢。細胞內(nèi)感染性細菌減毒后作為DNA疫苗載體是目前基因疫苗研究的熱點之一。沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)是一種較為常見的侵襲性胞內(nèi)菌，通過基因工程方法減毒后對宿主致病性顯著降低，但仍保留良好的侵襲力，可直接將表達

2、質粒攜帶進入動物細胞內(nèi)表達相應的蛋白而誘導特異性的免疫應答反應。但由于其質粒中含有抗生素抗性基因，盡管其在體外試驗有效，在人體內(nèi)卻無法應用，Nakayama等構建的平衡致死系統(tǒng)解決了這一問題。本課題擬構建幽門螺桿菌BabA2/UreI融合基因雙價DNA疫苗，首先通過基因工程技術構建含asd基因的重組原核表達質粒，并利用沙門氏菌asd平衡致死系統(tǒng)，最終獲得表達重組人BabA2/UreI融合基因蛋白的重組沙門菌減毒疫苗株x8501(pYA3

3、342/BabA2/UreI)，并檢測目的蛋白的表達和抗原性，為制備預防Up感染的DNA疫苗奠定基礎。 方法： ①BabA2/UreI融合基因的克隆：以pcDNA3.1(-)/BabA2/UreI融合基因重組真核表達質粒為模板PCR擴增BabA2/UreI融合基因，PCR產(chǎn)物連接到pCF-T載體上，用TSS法轉化到大腸桿菌DH5α，用氨芐青霉素和藍白篩選法挑選T-A克隆，并測序。擴增含有BabA2/UreI融合基因的大腸

4、桿菌DH5α，提取質粒，用SmaⅠ和SaⅡ酶切質粒，獲得高濃度的融合基因。 ②構建原核表達載體：SmaⅠ和SaⅡ雙酶切asd的組成型表達的原核表達載體pYA3342，將編碼BabA2/UreI的融合基因插入pYA3342，構建pYA3342/BabA2/UreI重組質粒；TSS法轉化入大腸桿菌x6212，篩選重組子；測序和酶切鑒定。 ③轉化減毒傷寒沙門氏菌x8501株構建活載體疫苗株：采用缺失天門冬氨酸-β-半醛脫氫酶(

5、Δasd)的傷寒沙門氏菌x8501作為載體菌，將pYA3342/BabA2/UreI重組質粒電轉化入減毒傷寒沙門氏菌x8501，構建表達BabA2/UreI融合基因平衡致死的減毒傷寒沙門重組菌x8501(pYA3342/BabA2/UreI)，，提取質粒，酶切和PCR擴增鑒定。 ④目的基因mRNA測定：RT-PCR檢測x8501(pYA3342/BabA2/UreI)mRNA的表達。 ⑤重組蛋白抗原性檢測：分別提取培養(yǎng)上

6、清和細菌蛋白，SDS-PAGE分離重組蛋白，以兔抗Hp的多克隆抗體為一抗，用Western Blot法檢測重組蛋白的抗原性。 ⑥重組疫苗穩(wěn)定性檢測：重組菌x8501(pYA3342/BabA2/UreI)在體外連續(xù)培養(yǎng)5天后，提取質粒，檢測穩(wěn)定性。 結果： ①利用PCR技術從pcDNA3.1(-)/BabA2/UreI中擴增出了BabA2/UreI融合基因，瓊脂糖凝膠電泳證實大小與預計一致，并成功構建了BabA2

7、/UreI的重組質粒pCF-T/BabA2/UreI。測序結果證實BabA2/UreI融合基因正確插入到pCF-T載體中。 ②成功構建了pYA3342/BabA2/UreI重組質粒，測序分析顯示所得序列完整，插入的基因片段全長2860bp，與基因文庫中的BabA2和UreI基因的同源性分別達100％和97％。 ③成功構建了表達BabA2/UreI的減毒傷寒沙門菌重組菌株x8501(pYA3342/BabA2/UreI)；

8、酶切和PCR擴增鑒定證實重組質粒成功轉入x8501。 ④RT-PCR結果顯示融合基因能有效轉錄。 ⑤免疫印跡顯示減毒傷寒沙門重組菌x8501(pYA3342/BabA2/UreI)可以表達融合蛋白BabA2/UreI，并能夠被兔抗Hp的多克隆抗體識別，分子量大約是106KDa，并可以呈現(xiàn)分泌性表達。 ⑥重組質粒能穩(wěn)定存在于宿主菌，并無丟失。 結論： ①成功構建pYA3342/BabA2/UreI重