支氣管敗血波氏桿菌的重組沙門氏菌基因工程疫苗研究.pdf

1、支氣管敗血波氏桿菌(Bordetellabronchiseptica,Bb)可引起豬發(fā)生肺炎和萎縮性鼻炎(Atrophicrhinitis，AR)，也是豬呼吸道疾病綜合征(porcinerespiratorydiseasecomplex，PRDC)的重要致病因子之一。更重要的是，Bb的先期感染易于導致其它多種病原的繼發(fā)感染，從而增加豬群呼吸道疾病的發(fā)病率和嚴重程度，造成嚴重經濟損失。以AR為代表的豬波氏菌病現(xiàn)已遍布養(yǎng)豬業(yè)發(fā)達國家，已成為

2、豬的重要呼吸道傳染病之一。本研究對Bb的病原流行病學、生物學特性、免疫原性基因、診斷方法和重組沙門氏菌基因工程疫苗進行研究，為我國Bb的流行病學分布提供理論依據，為豬波氏菌病的臨床診斷、預防與控制提供新方法。主要研究內容如下： 1.Bb的分離鑒定與病原流行病學研究 從全國十五個省市送檢的2,057份有肺炎或AR癥狀豬的肺臟等病料組織中分離出190株Bb和不同數(shù)量的共感染菌。2003～2006年間的Bb總分離率為9.2％；

3、不同省份Bb的總分離率介于7.5～14.1％之間；不同年份Bb的總分離率介于7.3～11.8％之間；Bb的分離率與豬日齡有一定關系。Bb最常見的共感染菌依次是鏈球菌(55.9％)、副豬嗜血桿菌(50.0％)、大腸桿菌(43.1％)、巴氏桿菌(25.5％)和綠膿桿菌(17.6％)。在43份有典型AR癥狀豬的病料中，分離出22株Bb、7株產毒素巴氏桿菌和6株綠膿桿菌；在分離出產毒素巴氏桿菌的7份病料中均同時分離出Bb，而其中6份又同時分離出

4、綠膿桿菌。研究結果表明，Bb在我國豬群的感染十分普遍，Bb與其它病原菌的共感染情況非常嚴重，且在AR的發(fā)生中具有重要作用。 2.Bb的生長特性及強毒菌株的篩選 Bb在多種培養(yǎng)基中均生長良好，但加血液的鮑-姜氏培養(yǎng)基更易于BbI相菌形態(tài)的維持，且在含綿羊血的鮑-姜氏培養(yǎng)基上產生更明顯的β-溶血環(huán)。小鼠致死性試驗結果表明Bb毒力普遍較弱，但少數(shù)菌株如1562、3331、HH0809等表現(xiàn)出很強的毒力。以HH0809株為出發(fā)菌

5、株分別建立小鼠和仔豬的呼吸道感染模型。采用建立的感染模型測定HH0809株對小鼠的LD50(the50％lethaldose)為1.4×105CFU，對豬的LD50為2.0×1010CFU，詳細記錄了感染小鼠和感染仔豬的癥狀和病理變化。Bb生長特性研究以及小鼠和仔豬的呼吸道感染模型的建立為豬波氏菌病快速診斷試劑及高效疫苗的研制、開發(fā)奠定基礎。 3.Bb保護性抗原基因的篩選 以強毒菌株HH0809的基因組為模板，分段克隆表

6、達Bb重要的保護性抗原絲狀血凝素基因fhaB(6,260bp)和百日咳桿菌粘附素基因prn(2040bp)。fhaB基因分為5段，從N端到C端分別命名為F5(1,400bp)、F4(1,200bp)、F3(1,200bp)、F2(1,800bp)和F1(660bp)；prn基因分為2段，從N端到C端分別命名為P1(1,190bp)和P2(850bp)，以及prn基因全段(2,040bp)；將8段DNA片段分別克隆到pGEX-KG表達載體

7、并在大腸桿菌BL21中進行誘導表達，純化包涵體后使用30μg(與等體積弗氏完全佐劑混合)免疫BALB/c小鼠，于21d后使用4×LD50的Bb強毒株HH0809進行呼吸道的氣霧攻毒。結果表明：fhaB基因各片段表達產物GST-F1、GST-F2、GST-F3、GST-F4和GST-F5免疫組小鼠的存活率分別為66.7％(6/9)、0(0/9)、0(0/9)、44.4％(4/9)和11.1％(1/9)：prn基因各片段表達產物GST-P1

8、、GST-P2和GST-PRN免疫組小鼠的存活率分別為88.9％(8/9)、100％(9/9)和100％(9/9)。小鼠保護力試驗結果證實FHA和PRN均是Bb重要的保護性抗原成分。其中，F(xiàn)HA的C端F1片段(TypeIdomain)和PRN的P2段(RegionIIdomain)分別為兩種抗原最重要的免疫保護性抗原區(qū)域，有望作為波氏菌病的診斷抗原和新型疫苗的成分。 4.Bb抗體檢測ELISA方法的建立與應用 利用已純化

9、的各段表達蛋白GST-F5、GST-F4、GST-F3、GST-F2、GST-F1、GST-P1、GST-P2和GST-PRN分別進行間接ELISA檢測方法研究。結果顯示，作為包被抗原，GST-PRN優(yōu)于其它各段蛋白。進一步通過凝血酶Thrombin酶切GST-PRN并回收，獲得純的不含GST載體蛋白的PRN蛋白片段。以PRN蛋白片段為抗原建立檢測PRN抗體的間接EIASA檢測方法。結果表明，PRN-ELISA方法特異性良好，該方法對豬

10、巴氏桿菌病等7種常見細菌性疾病陽性血清的檢測結果均為陰性；ELISA方法能夠檢測到人工感染仔豬14d的血清抗體IgG，比乳膠凝集方法高4～128倍，但與其符合率為100％；用該ELISA方法檢測2005～2007年間來自全國各地的1,229份豬血清樣本，陽性率為32.7％。該方法對2個陽性豬場的檢測結果表明保育期仔豬的合群導致豬群大量感染Bb。 5.表達Bb保護性抗原的重組沙門氏菌株的構建及生物學特性 將fhaBF1段和

11、prnP2段依次與pMD18-T載體連接，然后將F1-P2融合片段轉移連入沙門氏菌asd平衡表達質粒pYA3493中，制備重組平衡表達質粒pYA-F1P2。將pYA-F1P2和pYA3493分別電轉化豬霍亂沙門氏菌C500的asd缺失株C501中，制備重組菌株C501(pYA-F1P2)和空載體菌株C501(pYA3493)。研究結果表明，重組菌株C501(pYA-F1P2)保留了親本菌株C500的生化特性和抗原表型，能穩(wěn)定遺傳并高效分

12、泌表達Bb的rF1P2抗原；C501(pYA-F1P2)的毒力較親本菌C500降低了4.5倍。將C501(pYA-F1P2)分別高劑量接種仔豬和懷孕母豬觀察其作為重組疫苗的安全性。結果表明，該重組菌株和親本菌株C500接種的仔豬均沒有異常臨床表現(xiàn)；該重組菌株和親本菌株C500接種的懷孕母豬也沒有異常臨床表現(xiàn)，與沒做任何處理的對照組懷孕母豬所產仔數(shù)沒有差異。豬霍亂沙門氏菌C500弱毒株是我國廣泛使用的預防仔豬副傷寒的標準疫苗株。本研究利用

13、豬霍亂沙門氏菌C500弱毒疫苗株的asd基因缺失株構建平衡載體表達系統(tǒng)菌株C501(pYA-F1P2)能高效分泌表達Bb免疫原性重組抗原蛋白；該活疫苗株C501(pYA-F1P2)的毒力較親本菌株C500稍低，對斷奶仔豬和懷孕母豬均是安全的，有望成為新型豬波氏菌病-副傷寒二價活疫苗的候選菌株。 6.支氣管敗血波氏桿菌的重組沙門氏菌基因工程疫苗研究 利用表達Bb免疫原性基因F1(fhaB的TypeI)片段和prn基因的P2

14、(prn的Region2)片段重組豬霍亂沙門氏菌弱毒疫苗株C501(pYA-F1P2)，制備支氣管敗血波氏桿菌重組沙門氏菌基因工程疫苗，檢驗該重組活疫苗對免疫BALB/c小鼠和豬針對豬霍亂沙門氏菌和Bb攻擊的保護效力。將2.1×109CFU和2.1×108CFU重組菌株C501(pYA-F1P2)分別通過口服和皮下注射途徑免疫BALB/c小鼠，結果顯示兩種免疫方法均能產生較高水平的血清IgG，并保護小鼠抵抗10×LD50豬霍亂沙門氏菌強

15、毒株C78-1的口服攻擊(4/4)。但使用4×LD50Bb強毒株HH0809進行呼吸道氣霧攻毒后，口服免疫不能提供有效保護(4/22)，而皮下免疫能夠提供完全保護(22/22)。進一步檢測結果表明，皮下免疫能產生較高水平的肺臟IgG，口服免疫則不能。同時，皮下免疫重組蛋白HIS-F1P2的小鼠也能完全抵抗4×LD50Bb強毒株HH0809的攻擊。將1.2×1010CFU重組菌株C501(pYA-F1P2)通過頸部肌肉注射免疫20日齡仔豬

16、，結果顯示免疫仔豬能產生較高水平的針對沙門氏菌和Bb重組蛋白rF1P2的血清IgG，并能抵抗5×LD(Lethaldose)豬霍亂沙門氏菌強毒株C78-1的口服攻擊(4/4)。同時，免疫仔豬也能抵抗4×LD50Bb強毒株HH0809呼吸道途徑的攻擊(4/4)，而PBS組(0/4)和C501(pYA3493)載體對照組(1/4)均不能提供有效保護。另外，重組菌株C501(pYA-F1P2)組誘導仔豬抵抗Bb攻擊的保護力優(yōu)于重組蛋白HIS-