豬支氣管敗血波氏桿菌（Bb）的分離鑒定與血清抗體檢測.pdf

1、支氣管敗血波氏桿菌(Bordetellabronchiseptica,Bb)是一類定植在動物呼吸道黏膜纖毛上皮細胞上的革蘭氏陰性、需氧球桿菌，是引起豬萎縮性鼻炎(AtrophicrhinitisofSwine,AR)的重要病原菌，單獨感染可引起豬的非進行性萎縮性鼻炎(Non-progressingatrophicrhinitis,NPAR)，若與產(chǎn)毒素性多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida,Pm)混合感染則可引起豬的

2、進行性萎縮性鼻炎(Progressiveatrophicrhinitis,PAR)。AR是一種慢性接觸性呼吸道傳染病，其主要特征是鼻塞、打噴嚏、流鼻血、咳嗽、呼吸不暢、顏面變形或鼻梁歪斜等，屬于世界動物衛(wèi)生組織(OIE)的B類重大傳染病，亦被我國列為二類動物疫病，是進出口動物衛(wèi)生檢測標準中的必檢項目。本研究通過采集貴州省11個養(yǎng)豬場的豬鼻腔棉拭子進行了Bb的分離與鑒定；通過BbI相菌的篩選與鑒定，制備Bb凝集診斷抗原，對24個不同養(yǎng)豬群

3、進行Bb血清抗體的檢測；通過疫苗接種和藥物治療對AR污染種豬場A進行了控制與凈化研究。具體內容包括： 1、貴州省豬群Bb的分離與鑒定：采集11個養(yǎng)豬場156頭份鼻腔棉拭子進行Bb的分離，通過培養(yǎng)特性與生化特征的鑒定，結果細菌分離物在葡萄糖改良麥康凱中呈茶色或茶黃色菌落，在TSA上呈奶油狀菌落；染色鏡檢為革蘭氏陰性、無芽胞的球桿菌，硝酸銀染色可見周毛菌；經(jīng)生化鑒定，符合Bb生化特點的分離物共計34株，分離率為21.8％(34/15

4、6)。針對BbFlaA基因上游序列選擇合成一對特異性引物(Fla1/Fla2)，對34株Bb分離物進行PCR鑒定，結果所有分離物均能擴增出約240bp特異性DNA條帶，與傳統(tǒng)的生化反應鑒定完全一致，且最小檢出量為0.64Pg；而豬鼻腔和肺組織中常見的其它細菌均顯現(xiàn)陰性反應。將PCR產(chǎn)物進行酶切分析，結果酶切產(chǎn)物與DNAStar軟件分析結果相符合；克隆后測序，結果該基因片段全長為237bp，與預期大小和序列一致；應用該PCR方法對27份豬

5、鼻腔棉拭子進行臨床檢測，結果Bb檢出率為25.9％(7/27)，檢出率較傳統(tǒng)的細菌學方法高。 2、貴州省豬群Bb血清抗體的檢測：首先采用結晶紫染色法(CV)對貴州省Bb分離物進行I相菌篩選后，再行細菌的形態(tài)結構、培養(yǎng)特性和外膜蛋白分子量鑒定，結果CV+菌為深紫色菌落，節(jié)思明染色可見無色透明莢膜，在血平板上呈β溶血，經(jīng)SDS-PAGE電泳可見74kD蛋白帶，即為BbI相菌，而CV-菌為無色菌落、節(jié)思明染色未見莢膜、在血平板上呈γ溶

6、血，經(jīng)SDS-PAGE電泳無74kD蛋白帶，即為Bb菌相變異菌。利用I相菌制備Bb凝集診斷抗原，并確定凝集診斷抗原的最佳反應條件后，用于貴州省24個不同養(yǎng)豬群1077份血清樣本的Bb血清抗體檢測，結果在3個表現(xiàn)AR臨床癥狀的豬群中，Bb血清抗體的陽性率61.36％(54/88)：在12個未表現(xiàn)AR臨床癥狀的中豬群，Bb血清抗體的陽性率為6.71％(37/552)；在9個屠宰場的豬群中，Bb血清抗體的陽性率為8.92％(39/437)，表

7、明Bb血清抗體的陽性率與AR臨床癥狀出現(xiàn)具有相關性，且我省部分養(yǎng)豬場存在Bb隱性感染狀態(tài)，應加以重視。 3、AR污染種豬場的控制與凈化研究：在病原學檢查和血清學檢測中發(fā)現(xiàn)，種豬場A為AR感染較為嚴重的豬場之一。本研究采取疫苗接種和藥物防治，結合淘汰病豬和加強飼養(yǎng)管理等綜合措施，在項目實施期間，共淘汰臨床發(fā)病母豬(包括后備母豬)50頭，淘汰率為8.1％(50/620)；隱性帶菌豬經(jīng)藥物治療后快速育肥出售800頭；其余臨床健康豬只(