鼠疫亞單位疫苗的制備及其在獼猴中的免疫保護(hù)作用評價以減毒傷寒沙門氏菌為載體的鼠疫疫苗構(gòu)建及初步評價.pdf

1、第一部分鼠疫亞單位疫苗制備以及其在獼猴中的免疫保護(hù)評價
　　 目的：鼠疫是一種由鼠疫耶爾森氏菌(Yersinia pestis，以下簡稱鼠疫菌)引起的人畜共患烈性傳染病，通常有腺型、肺型和敗血癥型三種，其傳染性強(qiáng)、死亡率高、人類普遍易感，未經(jīng)治療的腺鼠疫病死率達(dá)50％至70％，而肺鼠疫發(fā)病迅猛，并可以直接在人群中傳播，如果治療不及時，病死率可以達(dá)到100％。疫苗是阻斷疾病傳播的最有效方式，研制出一種安全有效的疫苗是鼠疫防治工作的

2、重點(diǎn)與方向，可以更好的保障人民的生命安全。本實(shí)驗(yàn)力圖在實(shí)驗(yàn)室已有工作的基礎(chǔ)上，優(yōu)化F和V兩種蛋白的純化方法，并找到獼猴在鼠疫亞單位疫苗免疫保護(hù)過程中的規(guī)律，探討獼猴作為鼠疫疫苗動物模型的可行性。
　　 內(nèi)容：簡化實(shí)驗(yàn)方案，從鼠疫菌疫苗株EV76中純化出天然的F1抗原，并通過克隆表達(dá)并用腸激酶切除標(biāo)簽獲得了不帶標(biāo)簽與天然序列完全相同的V抗原，利用此兩種抗原制備亞單位疫苗，并用實(shí)驗(yàn)室在小動物實(shí)驗(yàn)中已篩選出的免疫方案對獼猴進(jìn)行了免疫。

3、獼猴共分SV1，SV2，EV76，佐劑空白對照四個組。在初次免疫的第21天加強(qiáng)免疫，并在第10周用鼠疫強(qiáng)毒株進(jìn)行攻毒，密切觀察兩周后，解剖動物，觀察其體內(nèi)鼠疫菌存活情況。在免疫的第2，4，6，8，10，11，12周取獼猴血清，測量其血清中的抗體產(chǎn)生情況及血清中細(xì)胞因子的分泌情況。
　　 方法：采用玻璃珠處理、飽和硫酸銨沉淀和分子篩過濾相結(jié)合的方案，從鼠疫菌減毒活疫苗株EV76的培養(yǎng)上清中提取天然的F1抗原。根據(jù)已知的lcrV核苷

4、酸序列，避開LcrV抗原產(chǎn)生免疫抑制作用的區(qū)段設(shè)計引物，克隆表達(dá)rV270抗原。表達(dá)產(chǎn)物先后經(jīng)過Co2+親和層析和Sephacryl S-200 HR凝膠柱純化，并在純化過程中應(yīng)用腸激酶切除His標(biāo)簽。純化的蛋白用免疫印跡法、N-末端測序、質(zhì)譜肽圖鑒定其性質(zhì)和純度。使用氫氧化鋁佐劑分別吸附兩種抗原后免疫獼猴，使用ELISA方法，測血清中抗體的產(chǎn)生情況和細(xì)胞因子的分泌情況。
　　 結(jié)果：通過SDS-PAGE電泳及WB實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，簡化

5、方案純化出的F1蛋白純度高且具有很好的免疫原性，經(jīng)腸激酶酶切除掉His標(biāo)簽獲得的rV270抗原，通過N-末端測序、質(zhì)譜測序等方法鑒定其序列正確。利用這兩種抗原制備了亞單位疫苗，免疫獼猴發(fā)現(xiàn)配制的亞單位疫苗可使動物產(chǎn)生較高的抗體滴度和并具有良好的免疫保護(hù)作用。
　　 結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)獲得了一種簡化的從鼠疫中大量純化天然F1抗原的方法；并通過腸激酶酶切的方法獲得了完全不帶標(biāo)簽并且無免疫抑制活性的rV270抗原；通過觀察獼猴對鼠疫菌感染的

6、敏感性和攻毒后的發(fā)病情況，在評價獼猴作為鼠疫動物模型可行性的同時，也得到了亞單位疫苗在類人靈長類中免疫保護(hù)的珍貴資料。
　　 第二部分以減毒傷寒沙門氏菌為載體的鼠疫疫苗構(gòu)建及初步評價
　　 目的：減毒沙門菌活疫苗是將抗原基因通過減毒的沙門菌這種載體進(jìn)入體內(nèi)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。它的特點(diǎn)是組合了減毒活疫苗強(qiáng)有力的免疫原性和亞單位疫苗的準(zhǔn)確度這兩個優(yōu)勢。這種活載體疫苗的一個顯著特點(diǎn)就是可以在體內(nèi)有效的誘導(dǎo)細(xì)胞免疫。對鼠疫而言，鼠疫菌

7、的在體內(nèi)的最終清除依賴于機(jī)體的細(xì)胞免疫，因此這種活載體疫苗在鼠疫疫苗中有著非常光明的前景。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖菢?gòu)建一株能在體內(nèi)穩(wěn)定存在的產(chǎn)生良好免疫保護(hù)作用的安全性高的以鼠傷寒沙門菌減毒株為載體的鼠疫活疫苗。
　　 內(nèi)容：本實(shí)驗(yàn)以減毒鼠傷寒沙門氏菌為載體構(gòu)建鼠疫活疫苗，并鑒定了其抗原的表達(dá)和分泌情況，體外傳代后檢查質(zhì)粒和片段在載體中的穩(wěn)定性，疫苗接種小鼠檢測了其免疫的安全性，并感染巨噬細(xì)胞，通過檢測TNF-α的分泌來初步判定構(gòu)建的減毒活

8、疫苗在體內(nèi)可能引起天然免疫和適應(yīng)性免疫的能力。
　　 方法：利用克隆技術(shù)將V抗原的片段克隆進(jìn)pYA248質(zhì)粒，并通過化學(xué)轉(zhuǎn)化和電轉(zhuǎn)化的方法分步將質(zhì)粒導(dǎo)入最終宿主菌。SDS-PAGE凝膠電泳和WB鑒定目的抗原的表達(dá)和分泌情況。免疫小鼠觀察疫苗的安全性。通過感染RAW264.7細(xì)胞觀察菌對巨噬細(xì)胞的激活作用。
　　 結(jié)果：以鼠傷寒沙門菌減毒株為載體構(gòu)建了鼠疫活疫苗，初步的實(shí)驗(yàn)證明，結(jié)果證明構(gòu)建的減毒鼠疫疫苗，能夠在胞外分泌表

9、達(dá)V抗原，并且體外傳代實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒和片段在載體菌中可以存在，109cfu口服免疫小鼠安全性良好，感染RAW264.7后能有效激活巨噬細(xì)胞，并刺激其分泌大量的TNF-α，
　　 結(jié)論：為了解決亞單位疫苗只能產(chǎn)生體液免疫的劣勢，我們選用鼠傷寒沙門氏菌作為鼠疫活疫苗的載體，并成功獲得了一株能穩(wěn)定分泌V抗原的疫苗株，免疫小鼠可發(fā)現(xiàn)其安全性良好，并且刺激巨噬細(xì)胞后能使其大量分泌TNF-α。說明這株菌免疫原性良好，還需要后續(xù)實(shí)驗(yàn)來觀察其在體