鼠疫二價(jià)顆粒疫苗和重組李斯特菌載體疫苗的研究.pdf

1、鼠疫耶爾森菌被普遍認(rèn)為是可能用于生物戰(zhàn)劑或生物恐怖的高致病微生物，同時(shí)，也存在肺炎型鼠疫在人類傳播導(dǎo)致致死性肺炎的可能性。用于人群使用的鼠疫疫苗有兩種，一種是用毒性鼠疫桿菌經(jīng)甲醛處理而成的死菌疫苗，另一種是用減毒突變株EV76制成的減毒活菌疫苗。但死菌疫苗成本高，內(nèi)毒素成分不確定，要求多次加強(qiáng)免疫，而且有不同程度的副作用，已經(jīng)停止了使用。EV76是耶爾森鼠疫桿菌的無(wú)色素突變株，其毒性雖然大大減弱，保護(hù)效果比死菌苗好，但它仍有使實(shí)驗(yàn)鼠致病

2、的毒性，EV76在人群使用，不同菌株的保護(hù)效果及副作用各不相同而受到質(zhì)疑，因而開發(fā)新的鼠疫疫苗很有必要。最近已有不少鼠疫疫苗的研究報(bào)道，包括亞單位疫苗，DNA疫苗和重組減毒沙門氏菌載體疫苗。盡管以上列舉的鼠疫疫苗策略都成功的被報(bào)道，但它們?nèi)杂性S多不足之處，包括副作用，對(duì)吸入性鼠疫缺乏保護(hù)，需要頻繁的加強(qiáng)免疫等。 本研究旨在研究一種全新的鼠疫疫苗，該疫苗要安全，廉價(jià)，并能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗原特異性免疫保護(hù)反應(yīng)，包括體液免疫反應(yīng)、細(xì)胞免

3、疫反應(yīng)和粘膜免疫反應(yīng)。另外，該疫苗要易于接種，以預(yù)防使用鼠疫桿菌發(fā)動(dòng)生物恐怖襲擊時(shí)，可以快速，大規(guī)模地自我接種。 通過在小鼠身上的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，鼠疫耶爾森菌的F1蛋白和V抗原蛋白是其重要的保護(hù)性抗原。本研究共分三部分，從鼠疫桿菌的F1和V抗原基因著手，應(yīng)用GEM顆粒疫苗系統(tǒng)和減毒李斯特菌載體疫苗系統(tǒng)用于開發(fā)理想的鼠疫疫苗。 第一部分：我們通過一種不含重組DNA，無(wú)繁殖能力的革蘭陽(yáng)性細(xì)菌菌體作為顆粒疫苗的核心(GEM)，通

4、過錨蛋白與重組表達(dá)的鼠疫耶爾森菌F1蛋白和V抗原蛋白結(jié)合制成鼠疫二價(jià)顆粒疫苗，滴鼻接種免疫Balb/c小鼠(疫苗免疫小鼠劑量定為：2.5x109 GEM/20μg protein/dose)，檢測(cè)該疫苗誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高滴度抗原特異性抗體反應(yīng)和抗原特異性T淋巴細(xì)胞分泌IFN—γ的能力。實(shí)驗(yàn)證明該二價(jià)鼠疫顆粒疫苗安全無(wú)毒，無(wú)副作用，滴鼻接種能產(chǎn)生高滴度的抗原特異性抗體，包括粘膜保護(hù)性抗體，但抗原特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)較弱，為彌補(bǔ)該顆粒疫苗這一弱點(diǎn)

5、，本研究通過在二價(jià)疫苗顆粒上同時(shí)結(jié)合上鼠疫桿菌的鞭毛素蛋白(革蘭陰性菌的鞭毛素蛋白是TLR5的配體)，上調(diào)了該疫苗刺激機(jī)體產(chǎn)生抗原特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)的水平。 第二部分：利用減毒李斯特菌作為疫苗載體，能刺激機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的抗原特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)的特點(diǎn)，我們構(gòu)建了分泌表達(dá)鼠疫F1和V抗原的鼠疫重組李斯特菌載體疫苗，滴鼻免疫接種Balb/c小鼠，檢測(cè)該疫苗誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗原特異性抗體反應(yīng)和細(xì)胞免疫反應(yīng)的水平。本章重點(diǎn)介紹了PrfA突變李斯

6、特菌株作為疫苗載體可以提高外源基因的表達(dá)水平，并提高了疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗原特異性免疫反應(yīng)。 第三部分：聯(lián)合接種二價(jià)GEM顆粒疫苗和減毒李斯特菌載體疫苗兩種鼠疫疫苗，通過同源性和異源性免疫接種策略(再次免疫時(shí)采用與初次免疫不同策略的疫苗)，研究其可否誘導(dǎo)機(jī)體同時(shí)產(chǎn)生強(qiáng)的細(xì)胞免疫反應(yīng)和體液免疫反應(yīng)，包括保護(hù)性粘膜免疫反應(yīng)，使兩種疫苗的優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)。實(shí)驗(yàn)證明，初次免疫接種鼠疫減毒李斯特菌載體疫苗，加強(qiáng)免疫接種二價(jià)GEM顆粒鼠疫疫苗，可同時(shí)誘

7、導(dǎo)出更強(qiáng)的抗F1、V抗原的細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)包括粘膜保護(hù)性免疫反應(yīng)。 本研究最重要的研究結(jié)果可概括為以下五點(diǎn)： (1)用GEM顆粒制作的鼠疫二價(jià)顆粒疫苗通過滴鼻接種，能誘導(dǎo)出高滴度的特異性體液免疫反應(yīng)，包括粘膜保護(hù)性免疫反應(yīng)。 (2)鞭毛素蛋白可以上調(diào)GEM二價(jià)鼠疫顆粒疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生的特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)。 (3)以減毒李斯特菌作為疫苗載體，鼠疫重組李斯特菌載體疫苗滴鼻接種，在脾臟和外周血單個(gè)核細(xì)胞中能誘

8、導(dǎo)出很強(qiáng)的抗原特異性T淋巴細(xì)胞分泌IFN—γ反應(yīng)。 (4) prfA基因突變減毒李斯特菌株(Listeria△actA prfA*G155S)，可提高外源目的基因的表達(dá)水平，也可增強(qiáng)疫苗誘導(dǎo)的特異性細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)。 (5)異源性免疫接種，即初次免疫接種減毒李斯特菌載體鼠疫疫苗，而加強(qiáng)免疫接種二價(jià)GEM顆粒鼠疫疫苗，可同時(shí)誘導(dǎo)出很強(qiáng)的抗F1、V抗原的細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)包括粘膜保護(hù)性免疫反應(yīng)。 本研究通過