李斯特菌對瘧原蟲感染的免疫保護作用.pdf

1、前言:
　　 瘧疾是由瘧原蟲感染引起的嚴重威脅人類生命的感染性疾病之一，但目前尚未有應用于臨床的有效瘧疾疫苗。動物模型和人體研究的結果均已表明:CD4+T細胞在抵抗紅內(nèi)期瘧原蟲感染過程中發(fā)揮著至關重要的作用。感染急性期以IFN-γ為主導的Th1型細胞免疫應答及巨噬細胞等免疫細胞的活化可有效地遏制瘧原蟲的爆發(fā)性增殖。對于瘧原蟲的肝內(nèi)期感染階段，動物實驗結果表明保護性作用有賴于CD8+T細胞活化所介導的特異性細胞免疫應答，CD4+T

2、、IFN-γ及中和性抗體也發(fā)揮重要作用。因此有效提高細胞免疫應答成為抗瘧疫苗研究的重要策略。
　　 單核增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes，Lm)是一種革蘭陽性胞內(nèi)寄生菌，它可引起人類食物源性感染。該菌的生物學特性及其誘導免疫應答的特點使其成為極好的疫苗載體。在抗腫瘤、抗感染以及免疫調(diào)節(jié)等方面的作用越來越受到關注。同時Lm的自然感染途徑是經(jīng)口感染，因而可誘導粘膜免疫應答。它相對安全，對健康人的致病力較弱

3、，近年來制備了多種減毒株，部分已通過Ⅰ期臨床實驗，安全性獲得認證。
　　 本研究中，我們建立了Lm與鼠瘧共同感染模型，觀察到Lm處理對P.y17XL感染小鼠具有保護作用。我們進一步研究了Lm在瘧原蟲感染進程中的免疫修飾作用及其產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)作用的機制，為瘧疾的疫苗研制提供新的思路。
　　 實驗方法:
　　 1、實驗動物、瘧原蟲及菌株
　　 6～8周雌性C57BL/6、BALB/c小鼠，SPF級，由中國醫(yī)學科

4、學院實驗動物研究所提供（許可證編號:SCXK京200420001）。致死型約氏瘧原蟲P.y17XL(Plasmodiumyoelii17XL)液氮凍存，由BALB/c小鼠周期性復蘇傳代。野生型李斯特菌Lm10403s由BALB/c小鼠傳代后于TSB培養(yǎng)液中-80℃保存。熱滅活李斯特菌(Heat-killed Lm，HKLm)由對數(shù)生長期Lm10403s PBS重懸后80℃熱滅活1h，-80℃凍存?zhèn)溆谩?br>　　 2、實驗動物感染

5、r>　　 瘧疾感染:C57BL/6、BALB/c每只小鼠經(jīng)腹腔感染5×105P.y17XL寄生紅細胞。P.y17XL感染后第3天開始，尾靜脈采血，制備薄血膜，Giemsa染色，動態(tài)監(jiān)測原蟲血癥水平、生存率。
　　 Lm感染:于P.y17XL感染兩天后（除在文中特殊注明外）經(jīng)尾靜脈感染李斯特菌，Lm10403s感染劑量400ul，BALB/c1×103 CFU，C57BL/61×104 CFU，HKLm感染劑量400ul，1×1

6、09 CFU。對照組注射同等劑量PBS。
　　 3、脾細胞培養(yǎng)
　　 無菌摘取小鼠脾臟，常規(guī)方法制備脾細胞懸液，用含10％FCS的RPMI1640調(diào)整脾細胞終濃度至1×107個/ml，于24孔培養(yǎng)板(Costar)中，每孔加入500ul細胞懸液，一式3孔，培養(yǎng)48h。收集培養(yǎng)上清，于-80℃保存，待NO測定。
　　 4、流式細胞術
　　 FACS檢測小鼠脾細胞CD4+T、CD8+T、CD11b+各細胞群百

7、分比及細胞內(nèi)細胞因子IFN-γ分泌情況，使用WINMDI2.9進行分析。
　　 5、NO水平檢測
　　 Griess試劑檢測脾細胞培養(yǎng)上清中NO含量，100ul細胞培養(yǎng)上清液和100ulGriess反應液室溫反應10min，酶標儀檢測550nm處OD值。以NaNO2作為標準品進行濃度換算。
　　 6、Realtime PCR檢測細胞因子
　　 TRIzol勻漿提取脾臟組織mRNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，保存

8、于-20℃作為RealtimePCR的模版，將RPS17作為內(nèi)參基因，檢測IFN-γ、 IL-4、IL-12P40及IL-10基因表達水平。
　　 7、統(tǒng)計學處理
　　 使用SPSS17.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行處理，標本采用獨立樣本t檢驗對數(shù)據(jù)做統(tǒng)計分析。P＜0.05代表差異具有統(tǒng)計學意義。
　　 實驗結果:
　　 1、接種Lm對P.y17XL感染小鼠原蟲血癥水平及生存率的影響Lm抵抗品系C57BL/6小鼠

9、在不同時間接種Lm的三組小鼠原蟲血癥水平均低于單獨感染P.y17XL對照組，并未觀察到生存率的差異;對Lm及P.y17XL更加易感的BALB/c小鼠Lm組在P.y17XL感染4天后相對于對照組原蟲血癥水平明顯下降，生存時間延長。
　　 2、接種Lm對P.y17XL感染C57BL/6小鼠Th1型應答的影響
　　 P.y17XL感染后第5天，接種Lm的C57BL/6小鼠脾細胞Th1型細胞因子IFN-γ分泌水平與對照組相比明顯

10、升高，Th2型細胞因子IL-4、IL-10水平無明顯差異;Lm組CD11b+細胞百分比出現(xiàn)明顯升高，脾細胞培養(yǎng)上清NO水平也顯著高于對照組;Lm組CD4+、CD8+T細胞數(shù)量與對照組基本相同，但Lm組CD4+、CD8+T細胞分泌IFN-γ的水平與對照組相比，明顯升高。
　　 3、IFN-γ與Lm對P.y17XL感染保護作用的關系
　　 P.y17XL感染后第3天（Lm感染后一天），Lm組IFN-γ分泌水平與對照組相比明顯

11、升高約5倍，HKLm組IFN-γ分泌水平與對照組相似，Lm組IL-12水平較低，與另兩組無差異。對照組IL-4水平相比另兩組出現(xiàn)有意義升高。C57BL/6小鼠HKLm組、Lm組蟲血癥在P.y17XL感染后的前5天相比于對照組一直保持在較低水平，Lm組5天后逐漸下降，并始終在保持10％以下，但HKLm組5天后開始逐漸上升至第8天與對照組基本一致。
　　 結論:
　　 1、Lm對P.y17XL感染的小鼠具有免疫保護作用;