單核細(xì)胞增生李斯特菌：無菌斑馬魚感染模型及Mmp-9在抗細(xì)菌感染中的作用機(jī)制.pdf

1、單核細(xì)胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，簡稱單增李斯特菌）作為四大食源性病原菌之一，在環(huán)境中廣泛存在，且對不良環(huán)境的耐受能力較強(qiáng)。人和動物食用了單增李斯特菌污染的食物后，細(xì)菌進(jìn)入消化道并跨越宿主腸道屏障，隨血液循環(huán)分布至全身臟器中，或穿過血腦屏障和胎盤屏障造成腦炎和流產(chǎn)等。單增李斯特菌擁有一套十分強(qiáng)大的毒力因子系統(tǒng)，感染過程中對宿主細(xì)胞的黏附和侵襲、細(xì)胞內(nèi)增殖和細(xì)胞間擴(kuò)散的每一步都由特定的毒力因子介導(dǎo)。內(nèi)化素

2、A(InlA)是該菌介導(dǎo)細(xì)菌黏附細(xì)胞的分子之一，能夠與宿主細(xì)胞表面的E-鈣黏蛋白共價結(jié)合，不同種宿主的E-鈣黏蛋白識別位點(diǎn)不同，因此InlA的識別具有宿主特異性。經(jīng)口感染單增李斯特菌在人源細(xì)胞上的黏附效率比在小鼠細(xì)胞上更高，是由于小鼠腸上皮細(xì)胞的E-鈣黏蛋白與人的在第16位氨基酸上有差異，不能與InlA有效結(jié)合。而斑馬魚的E-鈣黏蛋白在此位點(diǎn)上與人相同。
　　斑馬魚作為重要的模式脊椎動物之一，具有繁殖能力強(qiáng)、體外受精和發(fā)育、性成熟

3、周期短，胚胎透明、易于遺傳操作等諸多優(yōu)點(diǎn)。斑馬魚具有與哺乳動物相似類型的免疫細(xì)胞，且先天免疫系統(tǒng)在胚胎時期獨(dú)立于后天免疫而存在。以斑馬魚為模式動物建立病原微生物感染模型，對于病原的致病機(jī)制、宿主的先天免疫功能和病原與宿主之間互作關(guān)系的研究具有重要意義。然而普通斑馬魚飼養(yǎng)環(huán)境及其腸道內(nèi)的微生物可能會影響特定病原感染的研究，因此以斑馬魚為模型進(jìn)行感染與免疫研究需采用無菌斑馬魚。
　　本研究旨在:(1)建立無菌斑馬魚胚胎培養(yǎng)體系;(2)

4、建立單增李斯特菌多種途徑感染無菌斑馬魚胚胎的方法;(3)探明李斯特菌感染無菌斑馬魚胚胎轉(zhuǎn)錄組學(xué)特征;(4)探明基質(zhì)金屬蛋白酶9(Mmp-9)在介導(dǎo)巨噬細(xì)胞遷移和抗感染中的作用機(jī)制。
　　1.斑馬魚胚胎的無菌培養(yǎng)及評價
　　斑馬魚胚胎時期，后天免疫尚未發(fā)育（受精后4-6周），該時期是研究先天免疫功能的最佳時期。由于斑馬魚生活環(huán)境中微生物易大量繁殖，斑馬魚腸道中也有共生的微生物菌群，會激活斑馬魚先天免疫系統(tǒng)，從而影響試驗(yàn)結(jié)果。本

5、研究成功建立了斑馬魚胚胎培育的無菌操作系統(tǒng)，無菌檢驗(yàn)顯示其生活環(huán)境及體內(nèi)未檢測到能形成菌落的病原微生物，先天免疫分子Toll樣受體分子(Toll-likereceptors，TLRs)表達(dá)量較低或不表達(dá)，而常規(guī)培養(yǎng)斑馬魚以及浸泡感染單增李斯特菌的無菌斑馬魚中這些基因轉(zhuǎn)錄水平較高。我們認(rèn)為該無菌系統(tǒng)培育的斑馬魚胚胎能夠達(dá)到“相對無菌”，其先天免疫尚未激活，可應(yīng)用于免疫系統(tǒng)功能、腸道固有菌群功能和特定病原感染機(jī)制等研究中。
　　2.單

6、增李斯特菌不同感染途徑對斑馬魚致病性的影響
　　卵黃注射單增李斯特菌強(qiáng)毒株EGDe能夠引起斑馬魚迅速死亡，注射EGDe的斑馬魚卵孵化率為18％，相比弱毒株M7組80％、無害李斯特菌組88％和對照組90％的孵化率有顯著下降。腦室注射單增李斯特菌能夠引起斑馬魚胚胎逐漸死亡，并且能夠觀察到巨噬細(xì)胞遷移至腦內(nèi)吞噬細(xì)菌，細(xì)菌能夠在巨噬細(xì)胞中增殖。靜脈注射100 CFU強(qiáng)毒株EGDe后就能導(dǎo)致魚在一周內(nèi)全部死亡，細(xì)菌能夠在全身軀干血管、主靜脈

7、及眼周血管中分布并大量增殖，引起嚴(yán)重的感染。而弱毒株及無害李斯特菌則在感染后一定時間內(nèi)被魚體清除。以上三種注射感染途徑中，李斯特菌屬不同菌株的毒力與在小鼠模型中毒力相似:EGDe＞ M7＞無害李斯特菡。用高達(dá)1010 CFU/mL的EGDe浸泡感染斑馬魚雖不能引起死亡，但冰凍切片顯示48 hpi(hours post infection)時細(xì)菌大量存在于魚腸腔中未能突破腸道屏障，且在72 hpi被全部清除。強(qiáng)毒株感染組先天免疫基因cyp

8、1a、irgll、il1b和mmp9的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于弱毒株感染組、無害李斯特菌感染組和未感染組。這些基因表達(dá)在48 hpi達(dá)到頂峰，在72 hpi回落至正常水平，提示可能是這些基因參與了細(xì)菌清除。
　　3.致病性與非致病性李斯特菌浸泡感染斑馬魚幼魚的比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)
　　應(yīng)用Affymetrix基因芯片對斑馬魚14900個基因轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行雜交檢測，發(fā)現(xiàn)單增李斯特菌感染的斑馬魚相對于空白對照組有239個基因表達(dá)上調(diào)(fold≥2.

9、0)，56個基因表達(dá)下調(diào)(fold≤0.5)。無害李斯特菌感染的斑馬魚相對于空白對照組僅有25個基因上調(diào)，4個下調(diào)。而單增李斯特菌感染的斑馬魚相對于無害李斯特菌感染的魚有102個基因上調(diào)。其中Mmp-9上調(diào)倍數(shù)最多，達(dá)20倍以上。熒光定量檢測大部分基因表達(dá)趨勢與基因芯片結(jié)果一致。對單增李斯特菌感染組相對空白對照組上調(diào)的239個基因和相對于無害李斯特菌感染組上調(diào)的102個基因分別進(jìn)行Gene Ontology(GO)分析，發(fā)現(xiàn)這些上調(diào)的基

10、因大多富集于GO:0005576和GO:0050896，分別與細(xì)胞外基質(zhì)穩(wěn)態(tài)平衡和抵御應(yīng)激相關(guān)。將這些基因進(jìn)行Gene Cluster分析，發(fā)現(xiàn)在緊密連接、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、干擾素、熱休克蛋白、纖連蛋白、補(bǔ)體和肌動蛋白等分類下的基因均有不同程度的上調(diào)。這些結(jié)果提示斑馬魚可能通過改變細(xì)胞外基質(zhì)的穩(wěn)態(tài)來抵御單增李斯特菌感染，這一過程中Mmp-9可能發(fā)揮了重要作用。
　　4.Mmp-9在斑馬魚抗感染過程中的作用機(jī)制
　　Mmp-9屬于基質(zhì)

11、金屬蛋白酶家族，是一種鋅離子依賴的膠原蛋白酶，作用底物廣泛，能在各種細(xì)胞中表達(dá)并參與組織修復(fù)、細(xì)胞運(yùn)動、炎癥發(fā)生等多項(xiàng)生理及病理過程，近來也有報(bào)道Mmp-9在抗感染過程中也發(fā)揮一定作用。早期的研究均認(rèn)為Mmp-9水解細(xì)胞外基質(zhì)，有助于巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞在細(xì)胞外基質(zhì)中遷移。最近有研究發(fā)現(xiàn)，Mmp-9可能參與細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，激活細(xì)胞運(yùn)動相關(guān)的通路，從而引起細(xì)胞遷移運(yùn)動。我們利用特異Morpholino注射單細(xì)胞階段的魚卵，抑制M

12、mp-9表達(dá)，并對Mmp-9抑制后的魚進(jìn)行腦室注射、靜脈注射及浸泡感染。結(jié)果顯示，靜脈注射感染Mmp-9抑制的魚在24 hpi細(xì)菌載量顯著高于正常魚，在感染后2-3天內(nèi)全部死亡，比正常魚感染后死亡快。腦室注射感染后，Mmp-9抑制的魚中遷移至腦內(nèi)的巨噬細(xì)胞數(shù)顯著低于正常魚。浸泡感染雖仍不引起斑馬魚死亡，但Mmp-9抑制的魚出現(xiàn)消化道出血現(xiàn)象。
　　本研究還利用RNA干擾技術(shù)，結(jié)合小分子化學(xué)藥物作用，在小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)

13、胞模型上，對Mmp-9可能誘導(dǎo)的通路分子進(jìn)行了探索。細(xì)菌感染及LPS刺激能夠引起Mmp-9表達(dá)提高，同時也導(dǎo)致RAW264.7在Transwell上的遷移能力增強(qiáng)。沉默Mmp-9或Mmp-9在細(xì)胞內(nèi)可能的受體分子CD44均能導(dǎo)致細(xì)胞體外遷移能力減弱，但Mmp-9的沉默不影響細(xì)胞吞噬細(xì)菌的能力和形成偽足的能力，也不影響細(xì)菌ActA作用引起的actin tail形成。抑制細(xì)胞RhoA通路上游分子FAK，中游分子ROCK均能在一定程度上減少由

14、Mmp-9上調(diào)引起的細(xì)胞遷移，用細(xì)胞松弛素抑制肌動蛋白聚集后，由Mmp-9上調(diào)增多的細(xì)胞遷移活動完全被抑制。以上結(jié)果提示Mmp-9在抗感染過程中能夠介導(dǎo)巨噬細(xì)胞遷移至感染部位，從而達(dá)到清除細(xì)菌的作用。Mmp-9通過非水解酶作用，與CD44或其他細(xì)胞表面受體結(jié)合，誘導(dǎo)細(xì)胞運(yùn)動相關(guān)RhoA通路，從而引發(fā)細(xì)胞遷移運(yùn)動。
　　綜上所述，本研究建立了簡易的無菌斑馬魚胚胎培養(yǎng)體系，用此無菌系統(tǒng)培育的斑馬魚胚胎先天免疫尚未激活，可用于其先天免疫