單核細(xì)胞增生李斯特菌菌膜狀態(tài)下的抗氧脅迫分子機(jī)制.pdf

1、單核細(xì)胞增生李斯特菌（Listeriamonocytogenes）是一種能引起人畜共患病的食源性致病菌。它在自然界中普遍存在，能通過(guò)各種途徑進(jìn)入食品及其加工環(huán)境，由它引起的李氏桿菌病致死率高達(dá)20～30％。在食品生產(chǎn)環(huán)境中，該菌能形成菌膜來(lái)阻止外界脅迫環(huán)境對(duì)自身產(chǎn)生傷害，從而增加食品在加工過(guò)程中受到污染的幾率，為食品安全埋下隱患。
　　 單核細(xì)胞增生李斯特菌菌膜的現(xiàn)有研究多集中于一些生理反應(yīng)上，而在分子水平上，旨在揭示菌膜形成及

2、其在脅迫環(huán)境中反應(yīng)機(jī)理的研究還處于起步階段。2004年，本實(shí)驗(yàn)室利用轉(zhuǎn)座子Tn917隨機(jī)插入一株單核細(xì)胞增生李斯特菌4bG(Listeriamonocytogenes4bG)的基因組中，成功篩選到了一批菌膜形成能力發(fā)生變化的突變株。本論文在此基礎(chǔ)上，首先對(duì)轉(zhuǎn)座子Tn917在部分突變株基因組中的插入位點(diǎn)及其失活靶基因進(jìn)行鑒定和分析，發(fā)現(xiàn)一株轉(zhuǎn)座子插入失活突變株GB5表現(xiàn)出菌膜形成能力和抗氧脅迫能力同時(shí)減弱的表型;通過(guò)對(duì)該突變株失活靶基因g

3、ltB及其旁側(cè)序列的功能分析，初步探索了影響單核細(xì)胞增生李斯特菌4bG中菌膜形成和抗氧脅迫的分子調(diào)控途徑;同時(shí)通過(guò)觀測(cè)多種單核細(xì)胞增生李斯特菌血清型菌株的菌膜形成能力及抗氧脅迫生理表型，并測(cè)定相關(guān)抗氧脅迫基因的表達(dá)水平，進(jìn)一步研究該菌在菌膜狀態(tài)下的抗氧脅迫機(jī)制。本論文的主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:
　　 1、轉(zhuǎn)座子Tn917在菌膜形成能力變化突變株基因組中的插入位點(diǎn)及失活靶基因的鑒定。根據(jù)Tn917序列設(shè)計(jì)4對(duì)特異性引物進(jìn)行反向PC

4、R，對(duì)多株轉(zhuǎn)座子插入突變株的反向PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序及BLASTN比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)其中3株的Tn917插入位點(diǎn)。3株突變株的基因序列與已測(cè)序菌株L.monocytogenesstr.4bF2365對(duì)應(yīng)基因高度同源，根據(jù)同源基因進(jìn)行命名和注釋，GB1中插入基因?yàn)閘m.G_2324(1600bp)，編碼一個(gè)保守的假定蛋白(532aa);GB5中插入基因?yàn)閘m.G_1758，又稱gltB(4.59kb)，編碼谷氨酸合成酶大片段(1530aa);G

5、B8中插入位點(diǎn)為基因lm.G_1497(438bp)的啟動(dòng)子區(qū)域，該基因編碼一個(gè)MerR家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控子(145aa)。經(jīng)Southern雜交和回復(fù)突變實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，lm.G_2324、gltB和lm.G_1497基因的失活是引起GB1、GB5、GB8菌膜形成能力減弱的唯一原因。
　　 2、菌膜形成能力減弱突變株GB1、GB5、GB8與野生親本抗脅迫能力的比較分析。暴露于100mM的H2O2下，GB5的抑菌圈(直徑約為2.18cm)顯

6、著大于野生親本（直徑約為1.48cm），即GB5中基因gltB的失活造成菌膜形成能力和抗氧脅迫能力的同時(shí)減弱。此外，3株菌膜形成突變株GB1、GB5、GB8與野生親本在生長(zhǎng)能力、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性、抗酸脅迫能力、耐高滲透壓能力方面沒(méi)有表現(xiàn)出顯著性差異。
　　 3、突變株GB5中相關(guān)基因缺失突變株的構(gòu)建及其菌膜和抗氧脅迫表型的評(píng)價(jià)。利用溫敏性質(zhì)粒pAUL-A構(gòu)建gltB及其上游調(diào)控基因gltC的缺失突變株△gltB和△gltC，用96孔平

7、板法評(píng)價(jià)兩者的菌膜表型，基因缺失突變株△gltB和轉(zhuǎn)座子插入突變株GB5具有相同的菌膜形成表型，進(jìn)一步證明了gltB基因同菌膜形成能力的相關(guān)性，而基因缺失突變株△gltC表現(xiàn)出同△gltB類似的菌膜表型，說(shuō)明gltC同樣能影響菌膜形成。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用3種不同的氧化劑（過(guò)氧化氫、氫過(guò)氧化枯烯和過(guò)乙酸）處理△gltB和△gltC，與野生親本相比，兩者的抗氧脅迫能力都顯著減弱，揭示了基因gltB和gltC兩者都能正調(diào)控菌株的抗氧脅迫

8、能力。
　　 4、基因gltB和gltC對(duì)菌膜形成及抗氧脅迫能力的調(diào)控途徑分析。初步粘附實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與野生型相比，△gltB和△gltC在玻璃表面的粘附能力顯著降低，暗示了gltB或gltC基因的缺失可能是改變細(xì)胞表面粘附性的重要原因，這可能是引起菌膜形成能力減弱的原因。熒光定量PCR結(jié)果顯示，氧脅迫環(huán)境導(dǎo)致野生親本中的gltB基因表達(dá)量上調(diào)了8倍左右，gltC基因表達(dá)量上調(diào)了14倍左右，進(jìn)一步證明了gltB和gltC都參與了

9、細(xì)菌的抗氧脅迫反應(yīng)。在氧脅迫環(huán)境下，基因缺失突變株△gltC中的gltB基因比野生親本中的表達(dá)量下調(diào)了5倍左右，而△gltB中的gltC基因比野生親本中的表達(dá)量下調(diào)了3倍左右，說(shuō)明gltB和gltC基因在氧脅迫環(huán)境下能進(jìn)行正向互調(diào)控，解釋了△gltB和△gltC具有相同抗氧脅迫能力表型的原因?；騡ltC能編碼一個(gè)LysR家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控子，參照同一家族成員的功能并結(jié)合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，推測(cè)gltC基因編碼的調(diào)控子能影響一些氧脅迫相關(guān)基因和細(xì)胞

10、表面物質(zhì)合成基因的表達(dá)，進(jìn)而改變菌株抗性和菌膜形成，而gltB則是通過(guò)與gltC的互調(diào)控來(lái)實(shí)現(xiàn)影響菌株抗性和菌膜形成。
　　 5、單核細(xì)胞增生李斯特菌中與菌膜形成及抗氧脅迫相關(guān)基因的進(jìn)一步篩選。除了野生親本4bG菌株，選取血清型為4b和1/2a的單核細(xì)胞增生李斯特菌各6株，進(jìn)一步評(píng)價(jià)其菌膜形成和抗氧脅迫能力。發(fā)現(xiàn)在所測(cè)條件下，1/2a血清型菌株的平均菌膜形成能力（OD590約為1.17）顯著高于4b血清型的（OD590約為0.6

11、6），而在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期和長(zhǎng)期存活期(20天）內(nèi)，4b血清型菌株的平均抗氧脅迫能力成倍（＞2倍）高于1/2a血清型。利用Pearson相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)在長(zhǎng)期存活狀態(tài)下（20天）的4b血清型，其菌膜形成能力和抗氧脅迫能力呈現(xiàn)正相關(guān)性，而1/2a血清型的兩種能力間則沒(méi)有明顯關(guān)聯(lián)。熒光定量PCR結(jié)果顯示，氧脅迫相關(guān)基因sod，ri和perR在4b血清型菌株中的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于血清型1/2a，暗示這3個(gè)基因可能與4b血清型的強(qiáng)抗氧脅迫能力相關(guān)，而D

12、NA損傷修復(fù)基因recA在菌膜狀態(tài)下能夠高表達(dá)，說(shuō)明它在菌膜形成中可能具有重要地位。
　　 綜上所述，在單核細(xì)胞增生李斯特菌4bG中，鑒定出3個(gè)與菌膜相關(guān)的新基因lm.G_2324、gltB和lm.G_1497，其中g(shù)ltB能協(xié)同其上游調(diào)控基因gltC共同影響抗氧脅迫能力和菌膜形成能力，推測(cè)其調(diào)控途徑是通過(guò)gltC所編碼的調(diào)控子對(duì)一些細(xì)胞表面蛋白合成基因和抗氧脅迫基因的調(diào)控來(lái)實(shí)現(xiàn)的;除了gltB和gltC外，在常見(jiàn)血清型4b和1