單核細胞增生李斯特菌菌膜形成相關(guān)基因的鑒定及功能分析.pdf

1、單核細胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）在自然界遍布存在，并能通過各種途徑進入食品及環(huán)境，由于它能引起李氏桿菌病而成為食品業(yè)所關(guān)注的重要食源性致病菌。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，單核細胞增生李斯特菌能在食品加工廠的各種加工設(shè)備及環(huán)境（如墊圈、傳輸帶、切片機、包裝機、容器、排水管、地板和墻）的表面粘附生長并形成菌膜，成為該病原菌在食品廠長期存在的重要的原因。而生長于菌膜中的單核細胞增生李斯特菌因受到保護，難以徹底除去，這必然會導

2、致食品在加工過程中受到污染，成為食品安全的隱患。
　　 單核細胞增生李斯特菌菌膜的這種潛在威脅，使之成為近年來國內(nèi)外研究的熱點，但研究內(nèi)容多集中于對該菌菌膜形成的觀察上，而對其菌菌膜形成的分子機理的研究成果卻很少。本實驗室于2004年構(gòu)建了Tn917插入單核細胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes4b G)基因組突變子庫，從中篩選得到了菌膜形成能力增加的突變株LM-49。本文在此基礎(chǔ)上對Tn917引起突變株

3、LM-49基因組中失活靶基因及相關(guān)基因進行了鑒定和分析，探索了失活靶基因影響菌膜形成的機理，主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下：
　　 1、分析Tn917在突變株LM-49基因組中的拷貝數(shù)及插入位點基因，以確定由Tn917插入失活靶基因。(1)Southern雜交試驗結(jié)果顯示，Tn917在突變株LM-49中為單拷貝，表明轉(zhuǎn)座子Tn917在基因組中的插入位點只有一個。(2)反向PCR擴增Tn917插入位點旁側(cè)序列。對LM-49總DNA進行酶切

4、(HindⅢ，在Tn917上有兩個切點)和酶連環(huán)化；以環(huán)化后的DNA作為模板，根據(jù)Tn917已知序列設(shè)計出的兩對引物進行PCR反應(yīng)：引物對C427+Tn917F擴增得到Tn917的5’末端插入位點旁側(cè)序列1.5 kb大小PCR產(chǎn)物；引物對Tn4431+Tn5054擴增得到Tn917的3’末端插入位點旁側(cè)序列2.0 kb大小PCR產(chǎn)物。(3) PCR產(chǎn)物進行測序后，BLASTN比對分析顯示，插入位點基因序列與已測序菌株L．monocyto

5、genes str.4b F2365的LMOf2365-1771基因100％同源，編碼ABC轉(zhuǎn)運子透性酶蛋白(695 aa)，故將該插入位點的基因命名為lm.G_1771(1980bp)。
　　 2、分析插入位點下游基因lm.G-1770（編碼DNA結(jié)合反應(yīng)調(diào)控子）轉(zhuǎn)錄表達的變化，鑒定Tn917的插入對下游基因lm.G1770表達產(chǎn)生的極性效應(yīng)。半定量RT-PCR結(jié)果表明，在突變株LM-49中，Tn917插入位點下游基因lm.G

6、-1770的轉(zhuǎn)錄是組成型的；相對于野生型，突變株LM-49中的lm．G_1770基因的轉(zhuǎn)錄在不同生長階段并未發(fā)生改變，說明Tn917的插入對lm.G-1770沒有產(chǎn)生極性效應(yīng)。
　　 3、構(gòu)建重組載體、篩選LM-49的回復突變株及評價回復突變株LM-49RE菌膜表型，證實lm.G_1771基因失活是LM-49菌膜形成增加的唯一原因。結(jié)果表明：(1) PCR擴增得到野生型lm.G_1771基因片段AB，大小為1049 bp，連接于

7、溫度敏感型穿梭質(zhì)粒pKSV7（含氯霉素抗性基因）中，成功構(gòu)建了lm.G_1771基因的同源重組載體pKSV7-AB。
　　 (2)重組質(zhì)粒成功電轉(zhuǎn)化于感受態(tài)細胞LM-49中，含有pKSV7-AB質(zhì)粒的LM-49陽性轉(zhuǎn)化子，經(jīng)過雙交換得到Tn917敲出的回復突變株LM-49RE，重組幾率約為2.5%(18/700)。(3)回復突變株LM-49RE具有同野生型親本相同表型的菌膜形態(tài)結(jié)構(gòu)，說明了lm.G_1771基因的失活是造成菌膜形

8、成增加的唯一原因，證實了突變株LM-49表型的改變與突變位點基因的相關(guān)性。
　　 4、生物信息學分析Lm.G-1771轉(zhuǎn)運子蛋白在革蘭氏陽性細菌中的保守性。結(jié)果顯示：(1) lm.G1771轉(zhuǎn)運子透性酶蛋白在李斯特菌屬中高度保守，相似性超過95%以上。(2)lm.G_1771和上游基因lm.G-1772（編碼ATP結(jié)合蛋白）以基因簇的方式存在，極有可能形成一個操作子，共同編碼一個未知功能的ABC轉(zhuǎn)運子，命名為Lm.G1771轉(zhuǎn)運

9、子。(3)類似的ABC轉(zhuǎn)運子也存在于其他的革蘭氏陽性細菌基因組中，如芽孢桿菌中的ABC轉(zhuǎn)運子（由基因becAB編碼），金黃色葡萄球菌中的ABC轉(zhuǎn)運子（由vra基因編碼）。
　　 5、將野生型和突變株LM-49按1:1混合培養(yǎng)形成菌膜后，涂平皿測試菌膜中野生型細菌細胞和LM-49（帶有紅霉素抗性基因）細菌細胞的比例，分析Lm.G_1771轉(zhuǎn)運子可能的功能。結(jié)果顯示，菌膜中的野生型/突變株的細菌細胞數(shù)目基本保持不變（野生型細胞占52

10、%，突變株細胞占48%），說明野生型細菌細胞可能分泌出了一種抑制菌膜形成的信號分子，該信號分子對野生型和LM-49的菌膜形成產(chǎn)生了相同的抑制作用，否則，在混菌培養(yǎng)中，LM-49的菌膜形成能力遠大于野生型。
　　 6、構(gòu)建lm.G1771基因缺失突變株⊿1771，對缺失突變株⊿1771進行菌膜表型鑒定、AI-2發(fā)光檢測試驗、抗生素抗性試驗、Triton X-100誘導試驗及溶菌活性酶譜分析。結(jié)果表明：(1)缺失突變株⊿1771具有

11、與LM-49相同的菌膜形成能力，說明正是由于lm.G-1771基因的失活，才導致了菌膜形成能力的增加；(2) Lm.G1771轉(zhuǎn)運子并沒有參與信號分子A1-2的向外運輸作用：(3)突變株⊿1771對多個抗生素的敏感性增強，包括對作用于細胞膜的抗生素敏感性增強，說明lm.G1771可能參與了多個抗生素的轉(zhuǎn)運；(4)突變株⊿1771的自裂解活性略高于野生型菌株，有兩種水解酶參與了自裂解活性的增加，這一結(jié)果可以解釋突變株⊿1771對作用于細胞

12、膜的抗生素敏感性增強的原因。
　　 7、用雙向凝膠電泳及質(zhì)譜聯(lián)用分析野生型和缺失突變株⊿1771細胞中蛋白質(zhì)的差異表達。結(jié)果顯示：(1)對15個差異表達蛋白，有效鑒定出了11蛋白質(zhì)，其中，有3個蛋白質(zhì)在菌膜形成突變株⊿1771中表達量下降，有8個蛋白質(zhì)在突變株⊿1771中表達量上升；(2)在突變株⊿1771表達量下降的為50S核糖體蛋白L10、30S核糖體蛋白S6和天冬/谷氨酰-tRNA氨基轉(zhuǎn)移酶C亞基。這些與蛋白質(zhì)合成相關(guān)的蛋

13、白質(zhì)表達量的下降，說明某些蛋白質(zhì)的合成速度已經(jīng)開始減緩，這與菌膜細胞中的生長和代謝速度緩慢的特征是相符的；(3)在突變株⊿1771表達量上升的差異蛋白質(zhì)多為已證實的與菌膜形成相關(guān)的蛋白，如與壓力反應(yīng)相關(guān)的普遍脅迫蛋白和超氧化物歧化酶；與胞外蛋白運輸?shù)那绑w蛋白轉(zhuǎn)位酶和與表面蛋白固定于細胞壁的轉(zhuǎn)肽酶家族蛋白等，說明在細菌生長的穩(wěn)定期，突變株⊿1771己開始合成與菌膜形成相關(guān)的蛋白質(zhì)。
　　 8、用基因芯片分析野生型和缺失突變株⊿17

14、71細胞中基因的差異表達。結(jié)果顯示：(1)在突變株⊿1771中，表達下調(diào)的基因18個，表達上調(diào)的基因30個；(2)在突變株⊿1771中，發(fā)生表達下調(diào)的基因包括dlt操縱子、編碼ABC轉(zhuǎn)運子的基因和編碼核糖體蛋白的基因等。而表達上調(diào)的基因為包括轉(zhuǎn)肽酶基因(srtA)，與壓力反應(yīng)相關(guān)的超氧化物歧化酶基因(sod)和通用壓力反應(yīng)基因（usp），負責前體蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運的基因(yajC)和編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子GntR的基因等。這些基因的表達用qRT-PCR

15、進行了驗證，結(jié)果顯示，qRT-PCR的分析結(jié)果與基因芯片的結(jié)果一致。
　　 總之，通過上述試驗分析，結(jié)果顯示了一個新的Lm.G_1771轉(zhuǎn)運子透性酶可能參與了抑制菌膜形成的分子信號向外運輸，推測lm.G_1771基因正控制了dlt操縱子的表達，負控制了多個與菌膜形成相關(guān)的基因，如與壓力反應(yīng)相關(guān)的基因、與蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運相關(guān)的基因及編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)控子基因。正是由于lm.G_1771基因參與的這種多基因的調(diào)控作用，使缺失lm.G-1771基因