單核細胞增多性李斯特菌快速檢測方法的研究.pdf

1、單核細胞增多性李斯特菌(ListeriaMonocytogenes，Lm)是一種短小的革蘭氏陽性無芽胞桿菌，是一種人畜共患病的致病菌，可使人和動物患李斯特菌??；單增李斯特菌為食源感染菌中的低溫菌，其生長溫度在1～45℃之間，并可在肉類、蛋類、禽類、海產品、乳制品、蔬菜等多種食物中生長。 單增李斯特菌中毒在臨床上主要表現(xiàn)為腦膜炎、敗血癥和孕婦流產等，嚴重的可引起血液和腦組織感染。最近幾年，李斯特菌病在發(fā)達國家病死率高達20％～30

2、％；在美國，李斯特菌病被列為7種主要的食源性致死病之一；因此引起衛(wèi)生界的高度重視，被WHO評選為食品安全工作計劃檢測中的重點食源性疾病之一。檢驗檢疫部門、衛(wèi)生局、海關、醫(yī)院等衛(wèi)生檢測防疫部門已經(jīng)努力構建有關單增李斯特菌的檢測方法。 該項研究主要討論了免疫膠體金技術、PCR檢測技術在單核李斯特菌快速檢測中的應用。 免疫膠體金層析技術方法構建：采用檸檬酸三鈉改良法制備15nm膠體金顆粒，確定標記pH為8.2～9.0之間；單增

3、李斯特菌抗體最適蛋白質添加量分別是：OⅠ型28μg、OⅠ/Ⅱ型28μg、OⅣ型25μg、OⅤ/Ⅵ型16μg、OⅥ型21μg、OⅦ型21μg；運用硝酸纖維膜層析條帶、玻璃纖維、吸水材料、PVC底板組裝檢測試劑條。檢測方法：將待檢樣品與免疫膠體金混合，在層析試紙條上通過層析作用，與固定在硝酸纖維膜上的單核李斯特菌抗體和羊抗鼠IgG發(fā)生抗原抗體顯色反應。 PCR檢測技術方法構建：基于單增李斯特菌特異性的iap基因和hlya基因，建立P

4、CR檢測方法，分別設計了引物iap-1和iap-2，hlya-1和hlya-2；在36μlddH2O，5μl10×PCRbuffer，3μl25mmol/LMgCl2，4μldNTPs，0.1μl引物，0.5μl菌液反應體系下，建立適當?shù)姆磻绦?，對兩個基因進行擴增檢測。實驗結果：免疫膠體金技術能有效地對單增李斯特菌進行檢測，并具有快速，方便等特點，可制成試劑條運用于各個檢疫部門的現(xiàn)場檢測，在8～15min內檢測出結果，可檢驗出不同血清

5、型的單增李斯特菌；缺點：對低濃度的單增李斯特菌檢測的靈敏度相對較低，在菌體濃度為107cfu/mL以上，檢出率高達85.7％，低于這個濃度，不能檢出，會產生一定比例的假陰性。PCR技術檢測單增李斯特菌具有較高的靈敏度，能夠對低濃度的單增李斯特菌實施快速檢測；iap基因的擴增檢出靈敏度為106cfu/mL；針對hlya基因的擴增檢出靈敏度可達104cfu/mL。運用hlya基因擴增可檢出，105cfu/mL菌液濃度模擬感染的豬肉；但不能區(qū)