單核細(xì)胞增多性李斯特菌的主要毒力基因分析及其重組菌構(gòu)建與免疫原性.pdf

1、單核細(xì)胞增多性李斯特菌(簡稱單增李斯特菌，Lm)為重要的食源性病原菌，能引起人的敗血癥、腦炎、腦膜炎和胃腸炎，雖然發(fā)生率不高，但死亡率可達(dá)30％。不同來源Lm的致病性差異較大，有些菌株致病性很強(qiáng)，而另一些菌株毒力較弱甚至無致病性。將Lm減毒后作為攜帶外源基因的基因工程疫苗載體是近年來國外學(xué)者研究的熱點之一。國內(nèi)在Lm分離株的生物學(xué)特性、遺傳多樣性、基因結(jié)構(gòu)與功能及其疫苗載體的研究方面鮮見報道。 本研究以小鼠和雞胚LD<,50>試

2、驗及體外培養(yǎng)鼠成纖維細(xì)胞的空斑形成試驗比較了20株Lm食品及環(huán)境分離株的毒力。結(jié)果表明：大多數(shù)Lm分離株毒力與參考菌株10403S相當(dāng)，對小鼠的LD<,50>在10<'3.86>-6.10<'6.74>之間，對雞胚的LD<,50>在10<'1.23>-10<'3.35>之間，為強(qiáng)毒株；分離株H4對小鼠和雞胚的LD<,50>分別為10<'8.14>和10<'6.73>，為弱毒株。空斑形成試驗與LD<,50>結(jié)果基本一致，大多數(shù)單增李斯特菌

3、分離株感染孔均有清晰的空斑形成。相對于參考菌株而言，它們的大小在83.7％-108.3％之間，而弱毒株H4感染孔無可見空斑。 選取Lm的毒力基因actA，InlA和InlB高變區(qū)域外測保守區(qū)設(shè)計引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，T-A克隆至pMD18-T載體后進(jìn)行測序，對20個Lm的食品及其環(huán)境分離株進(jìn)行多位點序列分型?；赼ctA和InlA序列的分型結(jié)果基本一致，可將21個菌株分成6個亞型，與基于InlB的序列分型略有差異。綜合上述3個毒力

4、基因的分型結(jié)果可將所有菌株分成8個序列亞型，分別為S1-S8，其中菌株0194、10403S和H4各自成一亞型。用Sma Ⅰ對上述菌株基因組DNA進(jìn)行酶切，以脈沖場凝膠電泳(PFGE)方法將21個菌株劃分為6個亞型，分辨力與序列分型結(jié)果相當(dāng)，弱毒株H4自成。P6亞型。此外，分離自同一加工廠的海產(chǎn)品分離株1056，1057及其環(huán)境分離株6屬于同一序列或PFGE亞型，表明該加工企業(yè)成品中的Lm來自其加工環(huán)境。消毒奶分離株320與其環(huán)境分離株

5、690共為同一序列或PFGE亞型，表明成品奶中污染的Lm來自加工環(huán)境，而非奶牛場。 為探討Lm H4株弱毒的分子基礎(chǔ)，對其主要毒力相關(guān)基因(iap，prfA，plcA，hyl，mpl，actA，plcB，InlA和InlB)進(jìn)行了測序和系統(tǒng)分析。體外試驗表明：分離株H4與參考菌株10403S相比，具有相似的溶血活性和細(xì)胞侵襲力，但具有更強(qiáng)的細(xì)胞黏附力、更高的細(xì)胞內(nèi)增殖水平和更強(qiáng)的溶脂活性。而H4株對小鼠及雞胚的LD<,50>比菌

6、株10403S毒力分別低2.7和4.8個對數(shù)。菌株H4與10403S及EGD的prfA、plcA和mpl具有很高同源性(>98％)；與10403S菌株的hly基因核苷酸同源性為96.9％，氨基酸同源性為98.7％，體外溶血活性相似；與10403S菌株的plcB基因核苷酸同源性為95.4％，包含ORF第1位堿基及其上游序列-26位的突變(A-G，C-T)，有可能使ORF從-27位開始形成，這一變化可能導(dǎo)致H4的強(qiáng)溶脂活性。H4株在肌動蛋白

7、ActA的脯氨酸富集區(qū)有35個氨基酸缺失。本研究結(jié)果表明：單增李斯特菌H4株對小鼠和雞胚的低毒力可能與actA中脯氨酸富集區(qū)的部分缺失而引起的細(xì)胞間遷移能力下降或喪失有關(guān)。為探明單增李斯特菌弱毒株H4強(qiáng)溶脂活性的分子基礎(chǔ)，根據(jù)前期對plcBORF及其上游序列分析結(jié)果，首先設(shè)計引物擴(kuò)增plcB同源區(qū)(包含上游序列)，定向克隆至pUC18，構(gòu)建pUC18-plcB。設(shè)計3對點突變引物，以pUC18-plcB為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別將plc

8、B上游第26位(-26位)及ORF第1位雙突變或-26位單突變?yōu)閰⒖季?0403S的相應(yīng)堿基，測序確認(rèn)后命名為puC18-△plcB1、pUC18-△plcB2和pUC18-△plcB3。繼而亞克隆至pKSV7，構(gòu)建重組穿梭質(zhì)粒pKSv7-AplcB1、pKSV7-AplcB2和pKSV7-△plcB3，并將其電轉(zhuǎn)入H4株的感受態(tài)細(xì)胞中，利用同源重組技術(shù)實現(xiàn)目的堿基的置換，構(gòu)建H4的突變株H4-△plcB1、H4-△plcB2和H4-

9、△plcB3。目的片段的PCR擴(kuò)增及序列分析表明各突變株構(gòu)建成功。在含5％的卵黃瓊脂平板中，各突變株均無溶脂活性，表明H4菌株強(qiáng)溶脂活性由plcB上游第26位堿基的突變(C-T)、致其ORF從-27位開始形成有關(guān)，比參考菌株10403S多9個氨基酸。這一突變對H4株plcB基因表達(dá)的增強(qiáng)作用機(jī)制還有待進(jìn)一步探索。另外，小鼠LD<,50>試驗表明突變株H4-△plcB1毒力比其親本菌株H4提高1個Log，初步表明H4菌株中兩個膜裂解相關(guān)基

10、因辦hly與plcB的高效表達(dá)及協(xié)同作用可能增強(qiáng)了細(xì)菌對宿主細(xì)胞的毒性，并暴露于宿主的免疫系統(tǒng)而被清除，從而降低了對宿主的致病性。 單增李斯特菌為侵襲性胞內(nèi)菌，可在專職和非專職吞噬細(xì)胞內(nèi)存活并繁殖，是目前疫苗載體研究的熱點之一。以綠色熒光蛋白基因gfp為模式外源基因，以單增李斯特菌毒力基因hly為靶基因，通過基因切割．重疊延伸PCR法及同源重組技術(shù)構(gòu)建表達(dá)GFP的重組單增李斯特菌。首先構(gòu)建了pKSV7質(zhì)粒衍生體，此質(zhì)粒含有hly

11、的啟動子和信號肽序列，gfp片段及hly的同源區(qū)，通過電穿孔法把該質(zhì)粒轉(zhuǎn)入野生型Lm 10403S株，經(jīng)兩次等位基因交換將加片段整合入Lm染色體基因組中。目的片段的PCR、序列測定及該重組菌在顯微鏡下發(fā)出的綠色熒光表明該重組子的構(gòu)建成功。溶血試驗表明hly基因中g(shù)fp的插入后溶血活性消失，對Hela細(xì)胞的黏附和侵襲力降低。此外，小鼠及雞胚的LD<,50>試驗表明該重組菌比其親本菌株毒力下降了2個Log。以新城疫病毒(NDV)編碼融合蛋白

12、的截短片段Fα為外源基因，通過基因切割。重疊延伸PCR法將其插入到單增李斯特菌毒力基因plcB信號肽序列下游，定向克隆至穿梭質(zhì)粒pKsV7，并電轉(zhuǎn)入單增李斯特菌10403s，通過同源重組技術(shù)構(gòu)建攜帶NDv Fa片段的重組單增李斯特菌。PCR擴(kuò)增結(jié)果表明重組菌Lm-AplcB-Fa構(gòu)建成功。RT-PCR結(jié)果表明整合的外源基因能在重組菌中轉(zhuǎn)錄，SDS-PAGE及Western blot分析表明融合蛋白Fa能在重組菌中表達(dá)，與NDV陽性血清具

13、有免疫反應(yīng)性。毒力試驗表明重組菌對小鼠與雞胚的毒力降低，LD<,50>比其親本菌株下降1.7-2.3個Log。重組菌Lm-AplcB-Fα對細(xì)胞的黏附和侵襲力均低于親本株10403S(P<0.05)。然而，重組菌口服或腹腔免疫SPF雞后，均未能有效誘導(dǎo)針對NDV和融合蛋白Fa的特異性抗體，也未能保護(hù)NDV強(qiáng)毒的攻擊。其可能原因是重組單增李斯特菌在雞體內(nèi)持續(xù)存在時間短、增殖率低，進(jìn)而導(dǎo)致外源基因的低水平表達(dá)。 本試驗結(jié)果為深入探索