單核細(xì)胞增生李斯特菌InlC基因缺失株的構(gòu)建及其毒力和環(huán)境耐受性的研究.pdf

1、單核細(xì)胞增生李斯特菌（listeria monocytogenes，LM）是一種常見的食源性致病菌，可以引起人類的李斯特菌病。此菌是一種兼性胞內(nèi)寄生的革蘭氏陽性菌，可以引起孕畜（婦）流產(chǎn)和腦膜炎等疾病，是對(duì)人畜具有較大危害的人獸共患病病原。LM是短小的無芽胞桿菌，常呈V字形或成對(duì)排列，屬微需氧菌，對(duì)營養(yǎng)要求不高，在普通培養(yǎng)基上能生長，耐堿、耐鹽、耐熱。該菌生長溫度一般為30-38℃，但在4℃條件下仍能生長繁殖，其最低生長溫度為0.1-0

2、.4℃。根據(jù)菌體和鞭毛抗原成分，其中致病血清型有1/2a、1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、4b，而以4b型引起發(fā)病較多。LM是典型的胞內(nèi)寄生菌，不僅可以在吞噬細(xì)胞內(nèi)生長，也能在上皮細(xì)胞和肝細(xì)胞內(nèi)生長，可以通過損傷的黏膜經(jīng)神經(jīng)末梢的鞘膜侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)。該菌編碼與胞內(nèi)寄生生活循環(huán)有關(guān)的毒力基因有2簇，分別為李斯特菌毒力島1( LIPI－1)和李斯特菌毒力島2( LIPI－2)。LIPI—1有6個(gè)基因，兩側(cè)分別為prs和ldh位

3、點(diǎn)，從prs下游開始，依次為轉(zhuǎn)錄活化因子編碼基因prfA、plcA、hly、mpl、actA、plcB。LIPI－2又稱為內(nèi)化素小島，內(nèi)化素是指一個(gè)富含亮氨酸重復(fù)序列的蛋白質(zhì)家族，分為2個(gè)亞族，亞族1的代表是由InlAB基因編碼的 InlA和 InlB多肽，亞族2是由相對(duì)分子質(zhì)量較小(25000～30000)的蛋白質(zhì)組成，原形來自 LM的 InlC。鑒于此，本研究構(gòu)建了LM90SB2-△InlC基因缺失株，并開展了缺失株毒力和環(huán)境耐受性

4、研究，探討了LM的Inl C因子在其毒力和環(huán)境耐受性方面的調(diào)控作用，為LM弱毒疫苗的研發(fā)提供了科學(xué)依據(jù)。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴LM90SB2-△InlC基因缺失株的構(gòu)建與分子鑒定：首先，在NCBI網(wǎng)站上查找出InlC基因序列，設(shè)計(jì)出用于基因缺失的上、下游同源臂引物；然后，以LM90SB2DNA為模板，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增出InlC基因兩側(cè)的上游同源臂和下游同源臂；接著運(yùn)用基因重疊PCR（SOE-PCR）技術(shù)分兩步將擴(kuò)增出的上、

5、下游同源臂融合，獲得InlC基因缺失片段；然后將InlC基因缺失片段插入到穿梭載體PKSV7中，構(gòu)建重組穿梭質(zhì)粒pKSV7-△Inl C。將pKSV7-△InlC電轉(zhuǎn)化到LM90SB2中，用檢測引物（L1、L4）對(duì)電轉(zhuǎn)后的菌株和傳代培養(yǎng)的菌株進(jìn)行PCR鑒定及測序分析。結(jié)果篩選得到可以擴(kuò)增出1910bp和1026bp兩條目的片段的陽性轉(zhuǎn)化子；對(duì)陽性轉(zhuǎn)化子在氯霉素壓力41℃條件下傳代培養(yǎng)30代，獲得具有氯霉素抗性的單交換重組株；然后再在氯霉

6、素壓力41℃條件下繼續(xù)傳代培養(yǎng)至108代，得到只能擴(kuò)增出1026bp一條目的片段無氯霉素抗性的雙交換基因重組缺失株LM90SB2-△InlC；用新設(shè)計(jì)的旁側(cè)引物檢測只能檢測到一條長度為1480bp的條帶；繼續(xù)在無氯霉素壓力37℃條件下傳代培養(yǎng)30代，LM90SB2-△InlC無返祖現(xiàn)象，說明該缺失株具有遺傳穩(wěn)定性。⑵LM90SB2-△InlC基因缺失株對(duì)毒力的影響：通過小鼠半數(shù)致死量（LD50）、肝、脾、腦載菌量、溶血試驗(yàn)、鼠腦微血管內(nèi)

7、皮細(xì)胞粘附、侵襲和胞內(nèi)增殖試驗(yàn)分析缺失株LM90SB2-△InlC和野毒株LM90SB2在毒力上的差異。結(jié)果顯示：LM90SB2-△InlC的LD50為107CFU，LM90SB2的LD50為104.5CFU，LM90SB2-△InlC的LD50是野毒株的102.5倍（P＜0.01）；在不同時(shí)間點(diǎn)，LM90SB2-△InlC缺失株在小鼠肝和脾內(nèi)的載菌量均少于LM90SB2（P＜0.05）；溶血實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LM90SB2-△InlC以及

8、LM90SB2均呈現(xiàn)出β溶血；鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附、侵襲和胞內(nèi)增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：LM90SB2-△InlC的粘附率為2.63％，而野生株LM90SB2的黏附率為3.72%，兩者相差1.09%（P＜0.01）；LM90SB2-△InlC的侵襲率為0.033%，LM90SB2的侵襲率為1.40%，野生株對(duì)MBMEC的侵襲率明顯高于缺失株對(duì)MBMEC的侵襲率（P＜0.01）；在2-12h之間LM90SB2-△InlC在鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的

9、存活數(shù)量明顯是低于LM90SB2（P＜0.05）的。結(jié)果提示InlC與LM的毒力相關(guān)。⑶LM90SB2-△InlC基因缺失株對(duì)環(huán)境耐受性的影響：為了檢測缺失株在環(huán)境耐受性方面的變化，通過人工模擬不同溫度，不同pH的應(yīng)激環(huán)境，分析了LM90SB2-△InlC缺失株和野毒株LM90SB2在環(huán)境耐受性的差異。試驗(yàn)結(jié)果表明：與野毒株LM90SB2相比，LM90SB2-△InlC對(duì)溫度和pH的環(huán)境應(yīng)激耐受力幾乎沒有變化，提示在溫度、pH的應(yīng)激過程