單核細(xì)胞增生李斯特菌檢驗(yàn)

1、食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn),,李斯特氏菌屬,李斯特氏菌屬（Listeria ）普遍存在于環(huán)境中，最新的分類學(xué)研究表明，其分為六個(gè)種：單核增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）伊氏李斯特氏菌（Listeria ivanovii）英諾克李斯特氏菌（Listeria innocua）斯氏李斯特氏菌（Listeria seeligeri）威氏李斯特氏菌（Listeria welshimeri）格氏李斯特

2、氏菌（Listeria grayi） 在李斯特氏菌屬的六個(gè)種中，只有兩種致病菌：單核增生李斯特氏菌和伊氏李斯特氏菌可以引起老鼠和其他動(dòng)物發(fā)病。但是，其中通常只有單核增生李斯特氏菌和人類的李斯特氏菌癥（listeriosis）相關(guān)。因此，李斯特氏菌中最有檢測意義的是單核增生李斯特氏菌。,單增李斯特氏菌能引起人、畜的李斯特氏菌病，感染后主要表現(xiàn)為敗血癥、腦膜炎和流產(chǎn)等。它廣泛存在于自然界中。肉類、蛋類、禽類、海產(chǎn)品、

3、乳制品、蔬菜等都可被污染。該菌在4℃的環(huán)境中仍可生長繁殖，是冷藏食品威脅人類健康的主要病原菌之一。其易感人群主要為孕婦、老人、新生兒和免疫缺陷人群。大多數(shù)發(fā)達(dá)國家人類李斯特菌病發(fā)生率約為每一百萬人2-15例，死亡率為13-34%加拿大由單增李斯特氏菌污染肉制品引發(fā)李斯特菌病暴發(fā)，導(dǎo)致十幾人死亡。很多國家都已經(jīng)采取措施來控制食品中的單增李斯特氏菌，并制定了相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)。,按2009年國家食源性疾病檢測網(wǎng)的工作手冊1.定性檢測2.定

4、量檢測,檢樣25 g(ml)樣品+LB1增菌液225 mL，均質(zhì),,0.1 mL+10 mL LB2增菌液,,,,,科瑪嘉李斯特菌顯色培養(yǎng)基,PALCAM瓊脂,,,接種木糖、鼠李糖，36 ℃±1 ℃，24 h；同時(shí)于TSA-YE平板劃線純化，30 ℃±1 ℃，24 h～48 h,木糖-，鼠李糖+,,鑒定,結(jié)果報(bào)告,30 ℃±1 ℃，24 h,30 ℃±1 ℃，18 h～24 h,36 ℃

5、7;1 ℃，24 h～48 h,增菌培養(yǎng):LB1增菌液225 mL，于30℃培養(yǎng)24h, 吸取0.1 mL，加入10mL LB2增菌液中二次增菌。分離培養(yǎng):LB2 二次增菌液轉(zhuǎn)種于選擇培養(yǎng)基PALCAM和科瑪嘉瓊脂平板上，于37℃培養(yǎng)24 h，觀察各個(gè)平板上生長的菌落,各個(gè)平板上的菌落特征見表1。,表1 單核細(xì)胞增生李斯特菌在選擇性平板上的菌落特征選擇性瓊脂平板單核細(xì)胞增生李斯特菌科瑪嘉顯色培養(yǎng)基菌落為:藍(lán)色，周圍有白色暈圈.P

6、ALCAM瓊脂菌落:為灰綠色，小的圓形菌落，周圍有棕黑色水解圈，有些菌落有黑色凹陷,L.M在 Chromagar培養(yǎng)基生長特征,,L.M在OXA培養(yǎng)基生長特征,L.M在PALCAM培養(yǎng)基生長特征,MMA抑制性強(qiáng)，菌落小、形態(tài)不典型，很難與雜菌區(qū)分進(jìn)口PALCAM 、進(jìn)口OXA菌落較典型，易與雜菌區(qū)分CHROMagar菌落較典型，易與雜菌區(qū)分，對(duì)高污染食品中的雜菌抑制性較差,染色鏡檢將上述可疑純培養(yǎng)物做革蘭氏染色并做濕片檢查; 利斯

7、特菌為革蘭氏陽性短桿菌, 大小為0.4～0.5μm×0.5～2.0μm；用生理鹽水制成菌懸液, 在油鏡或相差顯微鏡下觀察, 該菌出現(xiàn)輕微旋轉(zhuǎn)或翻滾樣的運(yùn)動(dòng)。,該菌為革蘭氏陽性無芽孢桿菌，在純培養(yǎng)物中呈短小桿菌，在初齡培養(yǎng)物中呈球桿菌狀，在老齡培養(yǎng)物中呈長絲的長桿菌狀，有些細(xì)菌因此而變成革蘭氏陰性；為需氧或兼性厭氧菌，在20～25℃培養(yǎng)時(shí)能形成4根鞭毛，運(yùn)動(dòng)活潑；在37℃培養(yǎng)時(shí)無鞭毛，運(yùn)動(dòng)消失。,1.初篩 在我們前期工作

8、中發(fā)現(xiàn)，高污染樣品在選擇性瓊脂平板上可疑菌落較多，為避免漏檢和減少工作量，增加初篩步驟：挑取典型或可疑菌落接種在木糖、鼠李糖發(fā)酵管中，無須燒環(huán)同時(shí)TSA-YE平板上劃線分離純菌。,初篩及純培養(yǎng)自選擇性瓊脂平板上分別挑取5個(gè)以上典型或可疑菌落，分別接種在木糖、鼠李糖發(fā)酵管，于37℃培養(yǎng)24h；同時(shí)在胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA-YE）平板上劃線純化，于30℃培養(yǎng)24h-48h。木糖陰性為藍(lán)色，鼠李糖陽性為黃色，在TSA-YE平板上可疑菌

9、落為淡藍(lán)色。,單增李斯特氏菌生化性狀與其種間的區(qū)別,動(dòng)力試驗(yàn)將TSA-YE平板上的疑似菌落穿刺接種到SIM培養(yǎng)基中，于30℃培養(yǎng)24h-48h，李斯特菌有動(dòng)力，呈傘狀生長。溶血實(shí)驗(yàn)：將7%羊血瓊脂平板底面劃分為20-25個(gè)小格，從TSA-YE上挑取菌落刺種到血平板上，每格刺種一個(gè)菌落，并刺種陽性對(duì)照菌(單增李斯特菌和綿羊李斯特菌)和陰性對(duì)照菌(英諾克李斯特菌)，,于35℃培養(yǎng)24h-48h，穿刺時(shí)盡量接近底部，但不要觸到底面，同時(shí)

10、避免瓊脂破裂。 于明亮處觀察潔凈的血瓊脂平板，單增李斯特菌和斯氏李斯特菌在刺種點(diǎn)周圍產(chǎn)生狹小的透明溶血環(huán)，無害李斯特菌無溶血環(huán)，伊氏利斯特菌產(chǎn)生大的透明溶血環(huán)。注意：不要據(jù)此來區(qū)別李斯特氏各種菌，僅僅是一種溶血現(xiàn)象。用CAMP試驗(yàn)來確證李斯特氏各種菌。,協(xié)同溶血試驗(yàn) (cAMP):在血平板上平行接種金黃色葡萄球菌和馬紅球菌 (R.equi), 在它們中兩者之間垂直接種可疑李斯特菌, 但不要觸及它們, 于30℃培養(yǎng)24h～48 h, 檢

11、查平板中垂直接種點(diǎn)對(duì)溶血環(huán)的影響?？拷瘘S色葡萄球菌接種點(diǎn)的單核細(xì)胞增生李斯特菌的溶血增強(qiáng), 斯氏李斯特菌（L.seeligeri）的溶血也增強(qiáng), 而伊氏李斯特菌（L.ivanovii）在馬紅球菌附近的溶血增強(qiáng)。,金葡,單核,馬紅,伊氏李,對(duì)小鼠的毒力試驗(yàn) （可選擇） 將符合上述特性的純培養(yǎng)物接種于TSB-YE中, 于30℃培養(yǎng)24 h, 離心, 棄上清液，用0.85?無菌生理鹽水制備成濃度為1010cfu/mL的菌懸液, 取此

12、菌懸液進(jìn)行小鼠腹腔注射 3～5只, 每只0.5 mL，觀察小鼠死亡情況。致病株于2～5d 內(nèi)死亡。試驗(yàn)時(shí)可用已知菌作對(duì)照。單核細(xì)胞增生利斯特菌、伊氏利斯特菌（L.ivanovii）對(duì)小鼠有致病性。,血清學(xué)分型:  Lm是根據(jù)O抗原和H抗原的差異進(jìn)行血清學(xué)分型。雖然Lm有16種血清型，1/2a、1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、4ab、4b、4c、4d、4e、5、6a、6b和7，但只有3種血清型 (1/2a、1/2b

13、、4b)可引起疾病。從食品和患者中分離的菌株95％以上是1/2a，1/2b，1/2c和4b等血清型，而3a、3b、3c、4a、4c、4e、4d和7等血清型在食品中非常少見，也沒有引起李斯特菌病的報(bào)道。,一方面血清是進(jìn)口的，無國產(chǎn)的；另一方面只存在“O”抗原因子血清，并且各型之間含有多種共同的抗原因子，因此其血清學(xué)上鑒別意義不大。,2.商業(yè)生化鑒定系統(tǒng)的應(yīng)用 原國標(biāo)中未涉及，F(xiàn)DA、AOAC標(biāo)準(zhǔn)使用API 10300?、Vitek G

14、NI?（AOAC 989.13），這些方法都比較成熟，穩(wěn)定性較好，已被許多國家和組織的標(biāo)準(zhǔn)采用。我國許多單位也積累了較多的經(jīng)驗(yàn)，使用最廣泛的是API 10300?, Vitek GNI?，考慮到各種系統(tǒng)在國內(nèi)的實(shí)際應(yīng)用現(xiàn)狀，擬定在生化鑒定方面“采納API10300?或Vitek GNI?為傳統(tǒng)生化鑒定方法的選擇性替代方法”。,API10300,L.M的API10300鑒定結(jié)果,,單增李斯特菌編碼:2410、2510、2550、601

15、0、6110、6150、6410、6450、6510,,VITEK,采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)（PCR）特異性擴(kuò)增單核細(xì)胞增生李斯特氏菌溶血素基因(hlyA)，并評(píng)價(jià)該方法的特異性與敏感性。 結(jié)果 在706bp處出現(xiàn)nuc基因的目的片斷，只有單增李氏菌的目的片段獲得擴(kuò)增其它菌種擴(kuò)增均呈陰性；該方法可以檢測到3.3pg/μl的DNA。,引物 針對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌溶血素基因（hlyA）設(shè)計(jì)引物，委托上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。單核

16、細(xì)胞增生李斯特氏菌特異性引物序列如下：上游（F）：5´--GCCTGCAAGTCCTAAGACGCCAATC—3´下游（R）： 5´--CTTGCAACTGCTCTTTAGTAACAGC--3´,（3）擴(kuò)增條件：預(yù)變性94℃ 5min，變性95℃60s退火 63℃ 60s ，延伸72℃ 60s 30個(gè)循環(huán)，再延伸72℃8min，20℃ pause。（4）結(jié)果觀察：PCR產(chǎn)物用1.5％瓊