單核細(xì)胞增生李斯特菌RsbS通過(guò)SigB調(diào)節(jié)其對(duì)鹽應(yīng)激的抗性.pdf

1、單核細(xì)胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，簡(jiǎn)稱(chēng)“單增李斯特菌”），在自然界分布廣泛，能引起人和反芻動(dòng)物的感染。作為食源性致病菌，可以通過(guò)污染多種食物而傳播，如各種肉類(lèi)、奶類(lèi)、海產(chǎn)品等，人誤食被污染的食品而感染李斯特菌病。
　　單增李斯特菌對(duì)環(huán)境應(yīng)激具有較強(qiáng)的適應(yīng)性，能夠在寬泛的溫度、低pH、低水活度以及高鹽條件下存活。因?yàn)槠鋼碛幸惶拙艿目箲?yīng)激調(diào)控機(jī)制，能夠在遭遇環(huán)境變化時(shí)調(diào)控一系列抗應(yīng)激基因的表達(dá)。Si

2、gma B(σB)作為一種應(yīng)激調(diào)控因子存在于不同種的革蘭氏陽(yáng)性菌，如單增李斯特菌、枯草芽孢桿菌和葡萄球菌，在抗應(yīng)激過(guò)程中發(fā)揮重要作用。σB抗應(yīng)激調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在枯草芽孢桿菌中研究的較為透徹?？莶菅挎邨U菌中σB的活力受到一系列Rsb蛋白的調(diào)控。這些Rsb蛋白中包含蛋白磷酸酶和磷酸激酶，整個(gè)調(diào)控渠道通過(guò)磷酸化和去磷酸化來(lái)實(shí)現(xiàn)。李斯特菌擁有與枯草芽孢桿菌類(lèi)似的Rsb基因簇，但其對(duì)環(huán)境應(yīng)激的調(diào)控機(jī)制研究尚淺。
　　本研究旨在:(1)利用單增李斯

3、特菌rsbS缺失株，探究rsbS基因?qū)卧隼钏固鼐果}應(yīng)激的影響;(2)獲得具有σB依賴(lài)型啟動(dòng)子和綠色熒光蛋白基因（gfp）融合的報(bào)告質(zhì)粒，以探究單增李斯特菌應(yīng)激環(huán)境中的σB活性;(3)探明rsbS基因在單增李斯特菌在鹽應(yīng)激條件下對(duì)SigB表達(dá)的調(diào)節(jié)。
　　研究結(jié)果表明:ΔrsbS在正常培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)能力與野生株10403S相似，兩者相比差異不顯著，但ΔrsbS在5％NaC1應(yīng)激條件下的生長(zhǎng)能力卻明顯降低，且極顯著低于野生株的生

4、長(zhǎng)能力(P＜0.01)，此外，ΔrsbS在高鹽應(yīng)激(15％NaCl)培養(yǎng)基中的存活率與野生株相比也存在著極顯著的差異(P＜0.01)，提示RsbS介導(dǎo)該菌在鹽應(yīng)激環(huán)境中的生長(zhǎng)能力和存活。在正常培養(yǎng)條件下，對(duì)ΔrsbS生物被膜和溶血溶脂特性進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)ΔrsbS的生物被膜形成能力與野生株相比，差異極顯著(P＜0.05)，表明rsbS能夠介導(dǎo)細(xì)菌生物被膜的形成，但不影響細(xì)菌的溶血和溶脂能力。
　　為了探究RsbS對(duì)單增李斯特菌抗應(yīng)激

5、過(guò)程中σB表達(dá)水平的影響，構(gòu)建了攜帶σB依賴(lài)型啟動(dòng)子和gfp融合的報(bào)告質(zhì)粒pERL3-PsigB-gfp，該報(bào)告質(zhì)粒能夠直接、準(zhǔn)確地反應(yīng)σB的表達(dá)水平。結(jié)果表明，鹽應(yīng)激一定時(shí)間后，ΔrsbS中檢測(cè)到的GFP熒光值信號(hào)極顯著低于野生株（P＜0.01），進(jìn)一步對(duì)細(xì)菌轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在ΔrsbS中幾乎檢測(cè)不到σB的表達(dá)，且ΔrsbS中σB的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平均極顯著低于野生株(P＜0.01)，提示rsbS能夠顯著介導(dǎo)應(yīng)激環(huán)境中