產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌減毒突變株的構(gòu)建及其免疫生物學(xué)特性的研究.pdf

1、產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌(Listeriamonocytogenes，LM)是人獸共患李斯特菌病的病原，主要通過食用被LM污染的食品感染，能引發(fā)人的腦膜炎、發(fā)熱性敗血性胃腸炎、孕婦流產(chǎn)等，感染后發(fā)病死亡率約為25％。歐美國家曾多次暴發(fā)流行，LM對食品的污染與危害，已引起世界各國的普遍關(guān)注和高度重視，其中研制預(yù)防李斯特菌病的減毒活疫苗是重要的課題之一。另一方面，鑒于LM是胞內(nèi)寄生菌，減毒LM是非常有前景的疫苗載體之一。為此，本研究通過同源重組的

2、方式對血清型為1/2a的野生型菌株基因組中相鄰的兩毒力基因actA和plcB進(jìn)行缺失，獲得減毒重組菌株，并以減毒株開展了以原核和真核表達(dá)的不同方式運(yùn)送模式蛋白GFP的研究。為了對減毒株的免疫保護(hù)力進(jìn)行評價(jià)，以及從不同水平上證實(shí)基因的缺失，對毒力基因hly和actA在大腸桿菌中進(jìn)行了原核表達(dá)并對ActA蛋白進(jìn)行了單抗的研制。 減毒突變株的獲得不僅對李斯特菌病的預(yù)防具有重要作用，而且為構(gòu)建預(yù)防人類和動物疫病的疫苗載體奠定了基礎(chǔ)。此外

3、，對于LM闡明毒力因子的致病機(jī)理與免疫保護(hù)作用提供了條件。 1.產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌actA基因和hly基因的原核表達(dá)及ActA單克隆抗體的研制利用PCR技術(shù)從血清型1/2a的LM4株中擴(kuò)增出actA基因，經(jīng)克隆篩選和測序鑒定后，構(gòu)建成該基因的原核表達(dá)載體pGEX-6P-1-actA及pET-actA，轉(zhuǎn)入終宿主菌E.coli后，IPTG誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá)。SDS-PAGE電泳結(jié)果表明，actA基因在兩種載體中均獲得表達(dá)，融合蛋白

4、的大小分別約為120KD和97KD。以純化蛋白作為免疫用抗原進(jìn)行了ActA單抗的研制，獲得四株抗ActA的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，腹水單抗ELISA效價(jià)為1∶5×104～1∶1×105。選取單抗1A5進(jìn)行Western-blot分析，結(jié)果表明不僅能和表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行特異性反應(yīng)，而且與LM4多抗血清的Western-blot結(jié)果一致。這表明表達(dá)的ActA蛋白具有免疫生物學(xué)活性，同時(shí)進(jìn)一步證實(shí)了單抗的特異性。actA基因的原核表達(dá)及單抗的研制為

5、研究ActA蛋白的生物學(xué)活性及其致病作用奠定了基礎(chǔ)，也為該菌鑒定提供了新試劑。 李斯特菌溶血素(LLO)是產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌的主要毒力因子，利用PCR技術(shù)從血清型4b的LM菌株F4636中擴(kuò)增出編碼LLO的hly基因，經(jīng)克隆篩選和測序鑒定后，構(gòu)建成該基因的原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-6P-1-hly。SDS-PAGE電泳結(jié)果表明：LLO與谷胱甘肽在大腸桿菌中已融合表達(dá)，融合蛋白的分子量為82KD；溶血實(shí)驗(yàn)證明融合蛋白具有較強(qiáng)的裂解真核

6、細(xì)胞膜的作用，表明表達(dá)產(chǎn)物L(fēng)LO具有生物活性，其溶血效價(jià)達(dá)2.26×104HU/mg。由于hly基因是LM的高度保守的基因，這為研究血清型為1/2a的菌株激發(fā)機(jī)體對LLO的免疫應(yīng)答水平提供了材料，也為其致病與免疫機(jī)理、單抗研制和疫苗設(shè)計(jì)提供了條件。 2.減毒突變株LM4ΔactA/p/cB的構(gòu)建及鑒定為了確定用于減毒的產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌菌株，對初篩入選的血清型為1/2a的菌株LM1、LM2、LM3和LM4的分子生物學(xué)特性進(jìn)行了比

7、較研究。利用PCR技術(shù)均成功地?cái)U(kuò)增出4株菌株的hly基因、actA和plcB基因片段。以LD50的測定試驗(yàn)作為菌株毒力指征，對4株菌株的毒力進(jìn)行了測定。試驗(yàn)結(jié)果表明：4株菌株均為強(qiáng)毒菌株，其中菌株LM4的毒力最強(qiáng)，對BALB/c小鼠測得的lgLD50為4.19。根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定以LM4作為侯選菌株。 actA和plcB基因的編碼產(chǎn)物ActA和PC-PLC是與其致病性相關(guān)的主要毒力因子，本研究通過刪除這兩個(gè)基因?qū)崿F(xiàn)對血清型為1

8、/2a的野生型菌株LM4的減毒。在擴(kuò)增出待刪除基因兩翼的同源片段actA和plcB后，利用SOEingPCR方法將其拼接在一起，測序后插入穿梭載體pKSV7中，經(jīng)電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入LM4。通過溫度和氯霉素抗性壓力，實(shí)現(xiàn)兩次同源重組，對重組克隆用PCR方法進(jìn)行鑒定，將陽性克隆命名為LM4ΔactA/plcB。對野生型菌株和突變株的毒力測定結(jié)果分別為：菌株LM4的lgLD50為4.19，突變株LM4ΔactA/plcB的lgLD50為7.64，表明

9、刪除了actA和plcB基因之后，菌株的毒力顯著降低。以actA的原核表達(dá)產(chǎn)物作為抗原，以重組菌LM4ΔactA/plcB免疫小鼠后制備的多抗血清為一抗進(jìn)行Western-blot，結(jié)果未出現(xiàn)97KD的免疫印記條帶，從蛋白質(zhì)水平上亦證實(shí)了actA基因的缺失。 3.表達(dá)GFP的重組減毒突變株的構(gòu)建利用SOEingPCR的方法把模式蛋白GFP與LLO的啟動子融合在一起，通過同源重組的方式整合到LM4ΔactA/plcB已缺失的act

10、A與plcB基因之間，間接ELISA測定和Western-blot實(shí)驗(yàn)都證實(shí)rLM3-GFP在感染小鼠后可原核表達(dá)GFP。由此表明LM作為胞內(nèi)感染菌具備作為外源基因載體的能力。這為開展減毒重組菌與抗原遞呈細(xì)胞之間的相互作用及其誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答分析提供了材料。 4.減毒突變株的免疫生物學(xué)特性研究以巨噬細(xì)胞系、雞胚、小鼠和商品雞為試驗(yàn)材料，對減毒重組李斯特菌LM4ΔactAlplcB的免疫保護(hù)力和安全性進(jìn)行了系統(tǒng)研究。 細(xì)胞侵

11、襲性試驗(yàn)結(jié)果顯示，重組菌侵襲率低于野生型細(xì)菌。對雞胚LD50測定結(jié)果表明，重組菌lgLD50為5.223，野生型為2.423，半數(shù)致死劑量降低3個(gè)數(shù)量級；MTD測定結(jié)果顯示以接種劑量中107CFU和106CFU接種的雞胚中，野生型菌株在第四天10枚全部死亡，重組菌僅死亡3枚，由此表明重組菌對雞胚致病力降低。 在小鼠感染模型中，對臟器中LM分布動態(tài)測定結(jié)果顯示：重組菌在高于野生型103的劑量尾靜脈注射或高于野生型40倍的劑量下口服

12、免疫后，小鼠臟器中LM的數(shù)量低于野生型免疫組、清除的速度也顯著快于野生型免疫組。對小鼠抗LLO抗體的測定結(jié)果表明，重組菌能和野生型細(xì)菌同樣激發(fā)較高水平的抗體。在口服和尾靜脈注射免疫后，CD8+T細(xì)胞都在第7天達(dá)到高峰，且注射免疫方式產(chǎn)生的CD8+T細(xì)胞數(shù)量高于口服方式，CD4+T細(xì)胞在14天時(shí)達(dá)到高峰。小鼠免疫保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果顯示，重組菌免疫組對同種血清型LM的攻毒具有較好的免疫保護(hù)力，達(dá)到100％。 在商品雞的感染試驗(yàn)中，重組菌在

13、與野生型細(xì)菌相同劑量灌服或胸肌注射后，雞臟器中LM的數(shù)量低于野生型免疫組，被清除的速度也顯著快于野生型免疫組。兩種細(xì)菌在以相同的劑量首免和二免免疫雞21天后，對LLO抗體的測定結(jié)果表明，減毒菌免疫組雞的抗體水平低于野生型免疫組。但保護(hù)力試驗(yàn)結(jié)果顯示，重組菌免疫組對同種血清型LM的攻毒具有較好的免疫保護(hù)力，清除細(xì)菌的速度顯著快于空白組，對增重不造成影響。 本研究所獲得的減毒突變株具有較好的激發(fā)免疫應(yīng)答的能力和良好的安全性，可以作為