口蹄疫二價(jià)重組雞痘病毒疫苗的構(gòu)建及小鼠免疫試驗(yàn)研究.pdf

1、口蹄疫（Foot-and-Mouth disease，F(xiàn)MD）是由口蹄疫病毒（Foot-and-Mouth disease virus，F(xiàn)MDV）引起偶蹄動(dòng)物感染的烈性傳染病之一。目前FMD呈世界范圍流行趨勢(shì)，其血清型有O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3和Asia1型共7種，其中O型、Asia1型FMD在我國有過報(bào)道，特別是近幾年來O型、和Asia1型FMD在我國周邊國家或東南亞地區(qū)時(shí)有發(fā)生，對(duì)我國養(yǎng)殖業(yè)構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅。

2、　　目前用于FMD疫苗研制的重組病毒活載體主要有脊髓灰質(zhì)炎病毒、牛鼻氣管炎病毒、煙草花葉病毒、桿狀病毒及雞痘病毒等。雞痘病毒轉(zhuǎn)移載體具有其它載體無可比擬的優(yōu)勢(shì)，具體表現(xiàn)為：雞痘病毒基因組結(jié)構(gòu)較為龐大，能容納較大的外源基因；外源蛋白可被正確地表達(dá)，并在感染細(xì)胞中得到忠實(shí)地修飾，如糖基化、羧基化等；外源基因表達(dá)產(chǎn)物具有良好的免疫原性，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)的細(xì)胞免疫和體液免疫；嚴(yán)格的胞漿內(nèi)復(fù)制，避免了病毒基因重組入宿主細(xì)胞染色體的可能性

3、，消除了重組病毒應(yīng)用后對(duì)人畜的潛在威脅。本研究所使用的雞痘病毒轉(zhuǎn)移載體是以人工合成的串聯(lián)的痘苗病毒突變型 p7.5啟動(dòng)子以及由牛痘病毒A型包涵體（ATI）啟動(dòng)子構(gòu)成的復(fù)合啟動(dòng)子作為啟動(dòng)外源基因的啟動(dòng)子，可以大大提高外源基因的表達(dá)量。
　　本研究從含有口蹄疫病毒（FMDV）的牛水皰液中提取總 RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）擴(kuò)增Asia-I/JL株FMDV衣殼蛋白前體P1-2A基因及蛋白酶3C基因，并將其克隆到pM

4、D18-T載體,通過對(duì)重組質(zhì)粒的酶切鑒定，成功克隆了 FMDV衣殼蛋白前體 P1-2A基因和蛋白酶3C基因，其大小分別為2223bp和639bp,并構(gòu)建了 DNA重組質(zhì)粒 T-P1-2A-3C，經(jīng)酶切獲得 Asia-I型P1-2A-3C基因。以軍事獸醫(yī)研究所張洪勇博士構(gòu)建的O型 FMDV克隆質(zhì)粒T-P1-2A、質(zhì)粒pUMT-IL18為基礎(chǔ)，構(gòu)建了DNA重組質(zhì)粒T-P1-2A-IL18，經(jīng)酶切獲得O型口蹄疫病毒P1-2A-IL18基因。<

5、br>　　將酶切得到FMDV Asia-I型P1-2A-3C基因與FMDV O型P1-2A-IL18基因克隆至雞痘病毒表達(dá)載體質(zhì)粒 pUTAL上，構(gòu)建重組雞痘病毒轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒vUTAL-P1-2A-IL-18-P1-2A-3C。通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將vUTAL-P1-2A-3C-P1-2A-IL18與雞痘病毒282E4株共轉(zhuǎn)染雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)，通過Brdu三次加壓篩選，挑選出單克隆重組病毒株,經(jīng) RT-PCR和間接免疫熒光法檢測(cè)，

6、篩選出1株重組雞痘病毒在 CEF中能正確表達(dá)P1-2A-IL-18-P1-2A-3C基因盒。成功獲得了一株共表達(dá)O型和Asia-I型口蹄疫病毒 P1-2A-IL18基因和 P1-2A-3C基因的重組雞痘毒活載體疫苗候選株vUTAL-P1-2A-3C-P1-2A-IL18。以107 PFU/次的毒量接種小鼠，經(jīng)三次免疫后測(cè)定小鼠血清中抗FMDV特異性抗體水平、脾T淋巴細(xì)胞亞類數(shù)量變化以及特異性CTL殺傷活性等。
　　結(jié)果顯示：該重組