表達(dá)新城疫病毒HN基因的重組雞痘病毒及其免疫效力.pdf

1、新城疫是由副粘病毒科的新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)引起的一種禽類烈性致死性傳染病,是危害中國(guó)畜牧業(yè)的4大A類病之一.該實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建了表達(dá)NDV HN基因的重組雞痘病毒rFPV<,LP>-HN,經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)了該重組病毒免疫SPF雞后能夠完全抵抗NDV強(qiáng)毒的致死性攻擊,然而免疫含有母源抗體的商品雞商品雞后只能提供部分免疫保護(hù),基于此,該研究用毒力相對(duì)較強(qiáng)的雞痘病毒FPV<,282E4>作親本病毒,通過(guò)

2、同源重組方法將HN基因插入FPV<,282E4>中,構(gòu)建了能夠正確表達(dá)HN基因的重組雞痘病毒rFPV<,282E4>-HN,并對(duì)其遺傳穩(wěn)定性和免疫效力進(jìn)行評(píng)估.首先,從質(zhì)粒GEMHN上切下完整的HN基因后,插入到質(zhì)粒pFG1175-1的FPV基因組復(fù)制非必須區(qū)片段,使HN基因置于啟動(dòng)子P<,7.5>下游,獲得轉(zhuǎn)移載體pFGHN1175-1,用以轉(zhuǎn)染預(yù)先感染FPV<282E4>的CEF,經(jīng)含有X-gal的營(yíng)養(yǎng)瓊脂覆蓋后挑選藍(lán)斑,多次克隆純

3、化后獲得純化的重組雞痘病毒(rFPV<,282E4>-HN),以PCR方法確定HN基因成功插入到FPV<,282E4>內(nèi)和間接免疫熒光試驗(yàn)證實(shí)了rFPV<,282E4>-HN能夠正確表達(dá)HN蛋白.將rFPV<,282E4>-HN在CEF上連續(xù)傳20代后,用PCR方法擴(kuò)增出原代、10代、20代的重組病毒的HN基因.測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)10代和20代HN基因僅有1個(gè)堿基發(fā)生變異,氨基酸序列沒(méi)有變異.應(yīng)用轉(zhuǎn)瓶分別培養(yǎng)了三個(gè)代次的重組病毒,結(jié)果顯示各個(gè)

4、代次的重組病毒的產(chǎn)量沒(méi)有發(fā)生明顯的變化,IFA證實(shí)了三個(gè)代次的重組病毒均能正確表達(dá)HN蛋白,進(jìn)一步表明了rFPV<,282E4>-HN具有較好的遺傳穩(wěn)定性.用含有殘余抗NDV母源抗體的30日齡商品蛋雞進(jìn)行免疫效力實(shí)驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn),由于母源抗體的干擾,rFPV<,282E4>-HN和、rFPV<,LP>-HN在商品雞體內(nèi)誘生的HI抗體效價(jià)明顯低于ND油苗組的HI抗體效價(jià),免疫2l天后用劑量為10<'5>EID<,50>/羽的NDV強(qiáng)毒滴鼻攻

5、毒,結(jié)果發(fā)現(xiàn)wt-FPV免疫組和空白對(duì)照組的實(shí)驗(yàn)雞全部死亡,ND油苗、rFPV<,282E4>-HN和rFPV<,LP>-HN的免疫組的免疫保護(hù)率分別為100％、80％、68％.對(duì)SPF雞和商品雞實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)的體重進(jìn)行分析,結(jié)果表明兩種不同毒力的重組雞痘病毒對(duì)SPF雞和商品雞的生長(zhǎng)沒(méi)有明顯的影響綜上所述,表達(dá)NDV HN基因的重組雞痘疫苗有良好的遺傳穩(wěn)定性,在SPF雞上能對(duì)NDV強(qiáng)毒的攻擊提供100％的保護(hù),但在商品雞母源抗體的干擾仍是一