新城疫病毒M基因的克隆表達及其初步應(yīng)用.pdf

1、M蛋白是新城疫病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白之一。它位于病毒囊膜的內(nèi)表面，具有高度保守的抗原表位。本研究的目的是克隆并表達M基因，為建立ELISA方法奠定基礎(chǔ)。本研究將收獲接毒雞胚的尿囊液，超速離心沉淀病毒，采用TRIzol法提取病毒RNA，利用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)技術(shù)擴增出新城疫病毒M的cDNA。采用玻璃奶法回收純化目的片段，PCR產(chǎn)物通過T-A連接到線性克隆載體pMD18-TSimplevector。轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，篩

2、選陽性克隆，提取質(zhì)粒，進行酶切鑒定、PCR擴增鑒定，對目的片段測序，并與已知序列進行同源性比較，結(jié)果表明成功克隆了M基因(1095bp)。將M基因克隆至原核表達載體pGEX-6P-1，經(jīng)酶切鑒定和PCR鑒定，證明成功構(gòu)建了重組表達載體pGEX-M。將構(gòu)建好的融合表達載體在IPTG的誘導(dǎo)下在大腸桿菌DH5α中進行表達。融合蛋白GST-M的分子量約為66kD。Western-Blot免疫印跡分析，融合蛋白可與新城疫陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，說