點突變的雞Ii基因和Ii-新城疫病毒融合基因表達特性研究.pdf

1、Ii鏈是一種非多態(tài)性的Ⅱ型跨膜蛋白,其中一個重要功能是確保新合成的MHC Ⅱ分子的胞內(nèi)轉(zhuǎn)運。MHCⅡ-Ii復(fù)合體的內(nèi)體分選信號已被證明為Ii鏈胞漿尾部的兩個獨立的亮氨酸基元,即Leu 7/Ile8和Pro15/Met16/Leu17。雞Ii鏈胞漿尾部含有Leu8/Ile9和Val17/Leu18兩個基元,但基元周圍氨基酸是否對內(nèi)體定位功能發(fā)揮作用還未見報道。本研究利用大引物PCR定點突變法,將雞Ii鏈胞漿尾部兩個基元及其基元周圍氨基酸分

2、別突變?yōu)楸彼?Ala),然后連接到pEGFP-C1載體中,構(gòu)建一系列突變體。利用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法,將突變體轉(zhuǎn)染到COS-7細胞,熒光顯微鏡下觀察GFP-Ii融合蛋白的定位情況。結(jié)果顯示,兩個基元可以獨立調(diào)控Ii分子的內(nèi)化；突變Glu3、Glu4、Gln5、Ile9、Ser10、Ser15、Gly16、Val17或Pro19時,融合蛋白均定位于細胞漿,Ii分子內(nèi)化功能喪失；而突變Arg6、Asp

3、7、Ser11、Asp12、Gly13或Ser14時,融合蛋白均定位于細胞內(nèi)體,Ii分子內(nèi)化功能保持。結(jié)果表明,雞Ii鏈胞漿尾部兩個亮氨基酸基元具有獨立地內(nèi)體定位信號功能,同時,兩個基元功能的正確發(fā)揮需要周圍氨基酸特定的空間結(jié)構(gòu)支持。 各類動物Ii鏈的跨膜區(qū)是進化中最保守的部分。研究發(fā)現(xiàn),跨膜區(qū)在Ii分子自身聚合成三聚體中發(fā)揮重要的作用,在缺乏胞外區(qū)的情況下,跨膜區(qū)可以使Ii有效聚合成三聚體狀態(tài)。已證實人Ii鏈跨膜區(qū)Gln47,

4、Thr49和Thr50三個氨基酸對MHCⅡ-Ii復(fù)合物的形成是必須的。本文應(yīng)用大引物PCR突變法,將雞Ii基因的Gln47和Thr50氨基酸突變,構(gòu)建了C1-Q47A和C1-Tr50A重組質(zhì)粒。同時,MHCⅡ分子的α鏈和β鏈被亞克隆到pEGFP-N1載體,構(gòu)建了GFP-α、GFP-β重組質(zhì)粒。將C1-Q47A或C1-T50A和GFP-α、GFP-β共轉(zhuǎn)染COS-7細胞,利用Western blot和免疫共沉淀對雞Ii鏈跨膜的功能進行初步

5、探討。結(jié)果表明,突變Ii鏈跨膜區(qū)Gln47或Thr50氨基酸后,MHCⅡ-Ii復(fù)合物的形成受限。 Ii鏈可以應(yīng)用于構(gòu)建Ii.抗原表位嵌合體。一些研究者用Ii鏈序列作為基本的框架,將CLIP區(qū)用CD4+T細胞抗原表位基因序列替代,將該嵌合基因插入真核表達載體,構(gòu)建的嵌合體中的抗原表位能夠有效地呈遞給T細胞。關(guān)于雞Ii分子CLIP替代的DNA疫苗目前沒有研究報道,本文利用3輪重疊PCR將雞Ii基因的CLIP區(qū)去除,此時恰好形成了一個

6、HindⅢ酶切位點,再通過常規(guī)PCR擴增NDV的F343抗原表位基因,該基因片段長33個氨基酸,兩段帶有HindⅢ酶切位點。將F343基因通過單酶切連接入Ii分子內(nèi),構(gòu)建了C1-Ii-F343內(nèi)源性靶向抗原表位嵌合體DNA疫苗。同時,構(gòu)建了C1-F343非靶向DNA疫苗作為對照。30只6～8周齡的雌性BALB/c小鼠隨機分為5組,用內(nèi)源性靶向DNA疫苗(C1-Ii-F343)和非靶向DNA疫苗(C1-F343)于股四頭肌進行免疫,生理鹽