新城疫病毒F蛋白-Ii嵌合體與MHC分子結(jié)合特性的研究.pdf

1、在免疫系統(tǒng)中，主要組織相容性復合物（Majior histocompatibility complex，MHC）Ⅰ、Ⅱ分子作為肽受體，具有提呈抗原肽的功能。恒定鏈（Invariant Chain，Ii）是一種非多態(tài)性Ⅱ型跨膜糖蛋白，它是MHCⅡ分子生物合成及MHCⅡ分子結(jié)合外源性抗原肽過程中重要的分子伴侶。研究表明，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中Ii輔助MHCⅡ亞單位初始折疊和低聚化，并與MHCⅡ分子組裝成（αβIi）3九聚體，同時Ii的CLIP區(qū)（the

2、 class-Ⅱ associated Iichain peptide）即第81-104位氨基酸片段，占據(jù)MHCⅡ的抗原結(jié)合凹槽，有效屏蔽了MHCⅡ類分子在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中與內(nèi)源性抗原肽結(jié)合。細胞中缺乏Ii會導致MHCⅡα鏈和β鏈不能正確折疊，從而被較長時間滯留于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。
　　 迄今為止，Ii與MHCⅡ分子相互關(guān)系的研究多集中在哺乳動物，有關(guān)禽類的研究還未見報導。從推測的氨基酸序列分析看，人、小鼠、大鼠的CLIP區(qū)（尤其是91-99a

3、a：MRMATPLLM）是完全保守的，但這種高度的保守性未出現(xiàn)包括禽類在內(nèi)的其他物種中。對于雞Ii與雞Ⅱ類抗原遞呈分子亞單位在細胞中的定位如何，Ii鏈能否與MHCⅡα和MHCⅡβ的單鏈聚合，Ii鏈中的CLIP區(qū)在聚合中起何作用，外源性抗原肽替代CLIP后，Ii鏈是否還能與MHCⅡ鏈聚合?為了探討這些問題，我們構(gòu)建了表達紅色熒光蛋白（Red Fluorescent Protein，RFP）的雞Ⅱ類抗原遞呈分子亞單位即MHCⅡα鏈和β鏈的真

4、核表達載體和表達增強型綠色熒光蛋白（Enhanced Green Fluores cence Protein，EGFP）的Ii真核表達載體，使用瞬時表達系統(tǒng)，檢測Ii與單個MHCⅡ亞單位在COS-7細胞中的表達和定位，并通過免疫共沉淀進一步研究它們之間的相互關(guān)系。研究表明，帶有熒光蛋白的融合蛋白保持了目的蛋白（Ii、MHCⅡα和MHCⅡβ）的活性和標記蛋白（GFP和RFP）的特性且定位于細胞的內(nèi)膜系統(tǒng)；其次雞Ii鏈與單鏈MHCⅡα或MH

5、CⅡβ之間存在細胞內(nèi)的共定位，并且它們之間能夠形成復合體，在這一過程中CLIP區(qū)擔當關(guān)鍵角色。為了探索研制高效的核酸疫苗，我們將以新城疫病毒的F343抗原表位基因（aa327-359）替換雞Ii鏈CLIP編碼基因構(gòu)建的Ii嵌合體分別與單個MHCⅡ亞單位共轉(zhuǎn)染COS-7細胞，通過熒光顯微鏡觀察Ii嵌合體改變了抗原表位在細胞中的定位，并且通過免疫共沉淀證實用NDV的F343抗原肽取代CLIP區(qū)的Ii嵌合體保持與單鏈MHCⅡα或MHCⅡβ聚合

6、。這些結(jié)果提示，只要保持Ii分子基本的空間結(jié)構(gòu)，Ii鏈就能與MHCⅡα或MHCⅡβ鏈形成聚合體。因此，在新型高效基因疫苗的設(shè)計中，Ii可以充當抗原肽潛在的運輸載體將抗原肽靶向性地傳遞到MHCⅡ遞呈抗原分子的路徑中。
　　 病毒性抗原作為內(nèi)源性抗原由MHCⅠ類分子呈遞，而Ii分子作為MHCⅡ分子的伴侶蛋白主要協(xié)助遞呈外源性抗原。MHCⅠ類分子和MHCⅡ類分子的合成均起源于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，它們在細胞中的分選則發(fā)生在高爾基體的反面膜囊，MHC

7、Ⅰ類分子通過膜泡運輸離開高爾基體到達細胞表面，MHCⅡ類分子則進一步到達溶酶體。MHCⅠ與MHCⅡ所走路線的不同可能與Ii的引導有關(guān)。為了了解雞的Ii分子與MHCⅠ類分子之間的關(guān)系，本文還探討了它們之間是否存在相互作用。為此，我們首先獲得了雞MHCⅠ分子亞單位的基因，并進一步構(gòu)建了相應(yīng)的原核表達質(zhì)粒，用pET-32a和Rosseta菌組合表達帶有信號肽的MHCⅠα、MHCⅠβ2m。其次，我們構(gòu)建了能表達紅色熒光蛋白的雞MHCⅠ類抗原遞呈