新城疫病毒降解線粒體抗病毒信號蛋白MAVS的機制研究.pdf

1、新城疫（Newcastle Disease，ND）由新城疫病毒（Newcastle Disease Virus, NDV）引起，可致多種禽類死亡，給我國及世界養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的損失。NDV為副黏病毒科，禽腮腺炎病毒屬，單股負鏈RNA病毒，并且具有囊膜。其基因組結(jié)構(gòu)為3'-NP-P-M-F-HN-L-5'，分別對應編碼六種病毒結(jié)構(gòu)蛋白。
　　病毒感染細胞后各種各樣的免疫信號通路被激活，并產(chǎn)生抗病毒免疫反應和炎性反應來對抗病毒感染。模

2、式識別受體（PRRs）中的RIG-Ⅰ樣受體（RLR）是細胞質(zhì)中一類RNA解旋酶，它們可以通過其RNA配體結(jié)合病原相關(guān)分子模式（PAMP），識別非自身的病毒RNA。被感染的細胞中，這種相互作用可以通過觸發(fā)RLRs及包括MAVS在內(nèi)的其下游信號分子的活化，最終導致一型干擾素(IFN)的產(chǎn)生和炎性因子的產(chǎn)生，細胞做出抗病毒免疫應答。然而，很多病毒通過保護自身RNA不被識別，或靶向RLR信號通路中的信號分子等作用，以逃避細胞的先天性免疫應答。本

3、研究通過檢測NDV對MAVS的影響，來研究NDV對RLR信號通路的免疫逃避機制。
　　一、NDV感染細胞誘導MAVS降解
　　本研究分別使用了NDV三種毒株Herts/33、ZJ1、La sota感染HeLa和A549細胞，檢測RIG-Ⅰ樣信號通路中重要的接頭分子MAVS的表達水平的變化，結(jié)果顯示，三種毒株感染細胞前期都引起了MAVS表達水平的上調(diào)，而在感染后期都幾乎完全降解MAVS。說明NDV在感染細胞前期強烈活化了RLR

4、信號通路的活化，而后期又幾乎完全破壞了RLR信號通路的信號的傳導。
　　二、NDV通過PCBP2非依賴途徑誘導MAVS降解
　　有研究已證明病毒可以通過上調(diào)PCBP2泛素化降解MAVS，并且有實驗證明在敲低PCBP2的細胞中，NDV的復制受到抑制。為了驗證NDV是否通過PCBP2降解MAVS，本實驗使用了NDV三種毒株Herts/33、ZJ1、La sota感染HeLa和A549細胞，檢測PCBP2的表達水平的變化。結(jié)果顯示

5、NDV并沒有明顯地上調(diào)PCBP2，在敲低PCBP2之后對NDV復制也沒有影響，而在過表達PCBP2之后MAVS的表達量沒有明顯的降低。該結(jié)果表明，NDV并非通過上調(diào)PCBP2泛素化降解MAVS。
　　三、NDV通過蛋白酶體途徑誘導MAVS的降解
　　以上實驗已證實NDV可以降解MAVS，而泛素-蛋白酶體系統(tǒng)作為一種重要的系統(tǒng)，可介導真核生物體內(nèi)大部分蛋白質(zhì)的降解。為了驗證NDV引起的MAVS的降解是否為泛素化降解，本實驗選擇

6、了MG132作為蛋白酶體抑制劑處理細胞。結(jié)果顯示，使用蛋白酶體抑制劑之后，NDV引起的MAVS的降解受到了抑制，同時病毒的滴度也相應的降低了，表明NDV引起的MAVS的降解是泛素化降解。
　　四、NDV病毒蛋白對MAVS降解檢測
　　為了驗證NDV蛋白是否能直接降解MAVS，本實驗構(gòu)建了ZJ1的P/V/W真核表達質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染ZJ1的PN/W真核表達質(zhì)粒以及實驗室已有的Herts/33的P/M/NP真核表達質(zhì)粒后，檢測MAVS表