線粒體Mfn2-MAVS抗病毒信號通路在抗病毒口服液降低拘束應(yīng)激小鼠流感病毒“易感性”中的作用研究.pdf

1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模嚎共《究诜簽榕R床常用抗病毒中成藥，具有清熱祛濕、涼血解毒等功效。常用于風(fēng)熱感冒、溫病發(fā)熱、上呼吸道感染及流感、腮腺炎等病毒感染疾患。然而，由于缺乏合適的體內(nèi)及體外活性評價(jià)模型，其抗病毒藥效一直難以得到有效評價(jià)，作用機(jī)制也有待闡明。本課題在課題組前期工作基礎(chǔ)上，我們采用拘束應(yīng)激建立的流感病毒（H1N1）感染小鼠模型和應(yīng)激激素皮質(zhì)酮（CORT）建立的細(xì)胞易感性模型，研究抗病毒口服液對流感病毒易感性及流感繼發(fā)性肺炎的作用，并深入探

2、討其作用機(jī)制，旨在建立和拓展適合中藥藥效的篩選與評價(jià)方法的共性技術(shù)，為中醫(yī)藥防治流感的研究提供科學(xué)依據(jù)。
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　本論文首先研究了抗病毒口服液對應(yīng)激負(fù)荷小鼠流感病毒易感性的影響。將雄性昆明種（KM）小鼠隨機(jī)分為正常對照組（Control），病毒對照組（Virus），病毒+拘束應(yīng)激模型組（Restraint stress+Virus），病毒+拘束應(yīng)激+陽性藥達(dá)菲組（Restraint stress+Virus+30

3、.8mg/kg/d oseltamivir）（根據(jù)人的臨床劑量150mg/d折算），病毒+拘束應(yīng)激+抗病毒口服液低劑量組（Restraint stress+ Virus+12.3mL/kg/d KBD-L）（根據(jù)人的臨床劑量30mL/d折算），病毒+拘束應(yīng)激+抗病毒口服液高劑量組（Restraint stress+Virus+24.6mL/kg/d KBD-H）。實(shí)驗(yàn)組每天給藥2次并連續(xù)給藥7d，空白對照組和病毒對照組灌服等體積的生理鹽

4、水。給藥當(dāng)天給予拘束應(yīng)激22h，用通風(fēng)良好的50mL尖底聚丙烯塑料離心管作為小鼠拘束裝置，拘束期間小鼠禁食禁水，而對照組小鼠為非拘束但禁食禁水。小鼠拘束負(fù)荷22h后恢復(fù)第1d，將小鼠用乙醚輕微麻醉后以2× LD50的H1N1（A/FM/1/47）流感病毒液（35μL/只）滴鼻感染，對照組以等量PBS溶液滴鼻。從小鼠感染流感病毒后當(dāng)天起，每天定時(shí)測定小鼠的體重，觀察并記錄各組小鼠的發(fā)病癥狀、發(fā)病時(shí)間、死亡時(shí)間，連續(xù)觀察21d。此外，另一批

5、小鼠經(jīng)同樣的分組、給藥、拘束應(yīng)激和病毒感染等處理后，于病毒感染的第5d乙醚麻醉處死，采集肺組織，H&E染色觀察病理變化，檢測流感病毒核蛋白（NP）的蛋白和基因表達(dá)水平、以及炎癥因子白介素-1β（IL-1β）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的蛋白表達(dá)水平。
　　其次，本論文研究和探討抗病毒口服液調(diào)節(jié)流感病毒易感性的作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)動物分組及處理同上，所有小鼠在感染病毒的第5d，乙醚麻醉處死，收集肺組織，檢測肺組織中干擾素-β（IFN-

6、β）、干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白3（IFITM3）、線粒體融合蛋白2（Mfn2）、線粒體抗病毒信號蛋白（MAVS）、磷酸化干擾素調(diào)節(jié)因子3（p-IRF3）、核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）的基因或蛋白表達(dá)水平。此外，小鼠在拘束后第3 d，乙醚麻醉心臟取血，收集肺組織，檢測小鼠血漿中CORT含量和肺組織中Mfn2和MAVS的蛋白表達(dá)變化。
　　最后，采用CORT負(fù)荷A549細(xì)胞模型研究抗病毒口服液中的活性成分連翹苷、連翹酯苷A、芒果苷和（R，

7、S）-告依春的抗病毒作用。將藥物加入A549細(xì)胞預(yù)保護(hù)2h后，加入100μM CORT作用48h，洗去藥物后以10TCID50流感病毒感染A549細(xì)胞，收集細(xì)胞，提取蛋白，檢測NP、IFN-β和IFITM3的蛋白表達(dá)水平。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：本研究結(jié)果顯示抗病毒口服液高劑量組能夠延長感染病毒后小鼠的發(fā)病時(shí)間、生存時(shí)間，并降低小鼠死亡率，提示該藥對甲型H1N1流感病毒FM1株感染應(yīng)激小鼠有保護(hù)作用。并且，抗病毒口服液能夠降低感染流感病毒

8、的拘束應(yīng)激小鼠的肺指數(shù)，改善小鼠的肺水腫，有效地促進(jìn)流感病毒的清除，減少TNF-α和IL-1β的分泌，使局部病變組織炎癥減輕，表明抗病毒口服液對流感病毒H1N1感染應(yīng)激小鼠肺組織具有較好的保護(hù)作用。對其機(jī)制的初步研究結(jié)果顯示抗病毒口服液對拘束應(yīng)激小鼠血漿中CORT水平無明顯影響，但能顯著地恢復(fù)拘束應(yīng)激小鼠肺組織中MAVS水平和降低Mfn2蛋白表達(dá)；此外，抗病毒口服液能夠升高流感病毒感染應(yīng)激小鼠肺組織中MAVS和p-IRF3的蛋白水平，減

9、少NF-κB的蛋白表達(dá)水平，從而增加IFN-β的mRNA和蛋白水平，上調(diào)IFITM3蛋白表達(dá)。以上結(jié)果表明，抗病毒口服液中的活性成分不是通過中樞抗應(yīng)激作用降低流感易感性的，而是通過其對線粒體抗病毒信號（MAVS）通路的調(diào)節(jié)作用。根據(jù)高效液相（HPLC）分析方法對抗病毒口服液中活性成分的定量結(jié)果，利用CORT建立的細(xì)胞易感性模型對抗病毒口服液中主要單體成分進(jìn)行抗病毒藥效篩選，發(fā)現(xiàn)芒果苷、（R，S）-告依春、連翹苷和連翹酯苷A均能夠通過增加