新城疫病毒樣顆粒的構(gòu)建及其出芽機(jī)制的研究.pdf

1、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文新城疫病毒樣顆粒的構(gòu)建及其出芽機(jī)制的研究姓名：聞曉波申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：預(yù)防獸醫(yī)學(xué)指導(dǎo)教師：曹殿軍20060601為了研究N D v - L P 形成所必須的結(jié)構(gòu)蛋白以及所形成v L P 的形態(tài)學(xué)特性。熏組質(zhì)粒單獨(dú)或組合共轉(zhuǎn)染H e L a 細(xì)胞．發(fā)現(xiàn)N D v 的M 蛋白單獨(dú)襲達(dá)后，電鏡下觀察到了直徑l O O n f n 左右的空心結(jié)構(gòu)，其形態(tài)與囊實(shí)的病毒粒子相似，但直徑小于真實(shí)豹N B v 粒予；p

2、C A G G - M 、嬸A G G 鑊P兩種質(zhì)粒再加上p c A G G ．F 或p c A G G ．H N 組臺(tái)共轉(zhuǎn)染H e L a 細(xì)胞后，電鏡觀察到約1 5 0 n m 的v L P ；四種重維質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染所形成麴N D V _ L P 贏徑接近2 0 0 m ，其所裝配成的V L P ，無論是在形態(tài)上，還楚在氟徑大小上，都接近于真實(shí)的病毒粒子。該結(jié)果提示我們N D v 的M 蛋自單獨(dú)表達(dá)后，就可以形成v L P ，病毒的糖蛋

3、白F 或} I N 。不決定v L P 的形成與否，只是影響所裝配的v L P 大小。在桿狀病毒表選系統(tǒng)中，使用四元桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體p A c A 目來構(gòu)建重組桿狀病毒。此轉(zhuǎn)移栽體包含兩個(gè)反向的p l O 啟動(dòng)子和兩個(gè)反向的p o l y h c 出i n 啟動(dòng)予。將F 4 B E 9 株N D V F 基因上的所ⅣI位點(diǎn)和N P 基因上的石b I 位點(diǎn)進(jìn)行無義突變之萄，將全長的F 、N P 基因片段越及M 和H N 蒸困片段，將其克隆

4、到口M D l 8 ．T 載體，再將F 、N P 、M 和H N 棼因依次溉兜隆到桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體p A c A B 4 上，F(xiàn) 基因和M 基因均在p l O 啟動(dòng)子的操控之下，N P 棼因和H N 幕因聿每建到秘個(gè)p o l y h e d 血啟動(dòng)子F 游。構(gòu)建重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體p 觚A B 4 卞- N P ．M - } 黼，與線性化的桿狀病毒Ⅸq A 筵轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞s f 9 ，獲得了重組桿狀病毒r B a D F ．N P ．

5、M H N 。蝕斑純化和病毒滴度擴(kuò)增后，經(jīng)w e s t e mb l o t 試驗(yàn)在培養(yǎng)上消中檢測到了M 、N p 、F 幫} { N 四種蛋白漿表達(dá)，s 母細(xì)胞慮只檢測到了H N蛋自的襲達(dá)。雖然M 、N P 和F 蛋白的表達(dá)量相對于} Ⅲ蛋白來說比較低，但這洶種蛋白W 以相互作用，彤成顆粒結(jié)構(gòu)。這說明M 、N P 、F 和H N 四種結(jié)構(gòu)蛋白在桿狀病毒- 昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中能夠巍動(dòng)裝配或v L P ，并班如芽的方式釋放到細(xì)臆外。為了

6、進(jìn)步確定v L P 在昆蟲細(xì)胞中出芽L } I 所必須的結(jié)構(gòu)蛋白，又分別構(gòu)建了單獨(dú)表達(dá)M 、N P 、F 稠l { N 蛋自豹重組耗狀病毒，命名為r B a c - M 、r B 8 c - N p 、r 8 a c - F 秘r B a c ·H N 。將r B a c - M 、r B a c ．N P 、r B a c ．F 和r B a c ．H N 單獨(dú)或者組臺(tái)共感染昆蟲細(xì)胞，制作細(xì)胞超薄切片和細(xì)胞培養(yǎng)上清的負(fù)染樣品

7、+ 透射電鏡耀察細(xì)胞內(nèi)和培舞上清中的V L P 。r B a c ．M 單獨(dú)感染的s _ f 9 細(xì)胞超薄切片中，核內(nèi)觀察到直徑5 0 n m 左右的空心顆粒，而野生型桿狀病毒感染沒有觀察到此婁結(jié)構(gòu)：r B ∞- M和r B a c ．N P 共同感染s f 9 細(xì)胞后，細(xì)胞撥內(nèi)觀察到直徑5 0 n m ．1 0 0 m 的空心顆粒t 并且在S f 9 細(xì)胞膜外觀察到了v L P 的出芽。說明重維稈狀病毒表達(dá)托N D v 的結(jié)構(gòu)蛋自M

8、單獨(dú)或者在N P 蛋是的協(xié)同作j = } j 下，在昆蟲細(xì)胞內(nèi)自我裝配成v L P ，并且能以出芽的形式釋放到細(xì)胞外。但此兩種結(jié)構(gòu)蛋白所形成的v L P 直徑顯著小于真實(shí)的N D v 病毒粒子。重組桿狀病毒r B a c —M 、r B a c _ N P 、r B a c - F和，或r 8 粒．H N 組合共感染s 1 9 細(xì)胞，維稔核內(nèi)形成矗徑1 0 0 f 蝴的空心顆粒。r B a c —n N P - M ’H N 感染s f

9、 9 細(xì)胞，核內(nèi)的空心顆粒直徑也在5 0 ．1 0 0 n m 之間。r B a c * M 單獨(dú)感染昆蟲細(xì)胞s f 9 后，在培養(yǎng)上清中觀察到直經(jīng)約l O o n m 的v L P ，形態(tài)與N D v 相似；而r B a c - F —N p - M - H N 感染s f 9 細(xì)胞愿，可以觀察到1 5 0 ，2 0 0 n m 左右納v L P 結(jié)構(gòu)，形態(tài)和廒釋大小上均接近于真實(shí)的N D V 粒子。由此可見，在昆蟲細(xì)胞中，N D v