單抗夾心ELISA檢測雞新城疫病毒抗原的研究.pdf

1、該文分為兩部分.第一部分是鼠抗新城疫病毒(Newcastle Disease Virus NDV)單克隆抗體的制備及其生物學特性鑒定,第二部分是應用自制單抗建立夾心ELISA試驗方法并對其反應條件進行優(yōu)化.蔗糖密度梯度超速離心法純化NDV效果良好.接種NDV F48E9株于1 0~11日齡雞胚尿囊腔,平均每枚雞胚收獲尿囊液約8mL,血凝價(HA效價)在2<'9>~2<'12>之間.尿囊液粗提后再經20~60％、梯度為20％的蔗糖密度梯度

2、超速離心法進一步純化,在40~60％的蔗糖梯度層有一乳白色的病毒帶.透析后,測其HA效價高達2<'15>,較純化前有明顯提高.用Folin酚法測得病毒的蛋白濃度約為1mg/mL.建立了篩選陽性雜交瘤細胞的間接ELISA試驗方法并對其反應條件進行優(yōu)化.當純化的NDV抗原每孔包被47ng,酶標抗體羊抗鼠IgG-HRP的稀釋度為1:800時,陽性對照的OD492值大于1.0,而陰性對照的OD492值小于0.1.分別用鼠抗NDV抗血清和健康鼠血

3、清作為陽性和陰性對照,對照血清的稀釋度為1:1600.用蔗糖密度梯度超速離心法純化的NDV作為抗原,按常規(guī)方法免疫6~8周齡雌性Balb/C小鼠.小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞SP2/0按2:1至5:1的比例混合,經50％PEG 4000融合后,HAT培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)10~12天進行陽性篩選.融合細胞分置6塊96孔細胞培養(yǎng)板培養(yǎng),共576孔,其中391孔有雜交瘤細胞生長,融合率為67.9％;經間接ELISA檢測上清得陽性細胞孔數40,陽性率為6.

4、9％.挑選出其中OD492值在1.0以上的孔共10孔進行有限稀釋法克隆或亞克隆.最終得到3株能穩(wěn)定分泌抗體并產生腹水的雜交瘤細胞3株,分別命名為1F9、1C6、4D5.按5×10<'5>細胞/0.2 mL/只的量將3株雜交瘤細胞分別注入小鼠腹腔,約15天后,小鼠腹部明顯漲大,用注射器分次收集腹水,腹水呈黃色至淡血紅色不等.平均每只小鼠可獲4~5mL腹水.應用辛酸-硫酸銨法對腹水進行純化,蛋白得率為28.2％~31.4％.對3株單抗的部分

5、生物學特性進行鑒定,結果為:三株單抗均具有較高的ELISA效價(1.5×10<'4>~1×10<'5>);1 F9、4D5兩株單抗同時具有較高的HI效價(2<'9>,2<'8>),而中和效價(VN)偏低(二者都小于1 0);單抗1C6株具有較高的VN效價(10<'3>),卻無血凝抑制能力(HI效價為0).配對試驗的結果顯示:1C6、4D5分別作為包被單抗和酶標記單抗時,ELISA反應有較高的OD492值,系統(tǒng)的敏感性較其它組合要高.在此

6、基礎上建立了單抗夾心ELISA試驗方法,并對其反應條件進行優(yōu)化.試驗結果表明:酶標板經紫外線照射處理,包被單抗1C6、酶標單抗4D5-HRP分別作800倍、1600倍稀釋,包被液、封閉液、酶標抗體稀釋液分別選用0.05mol/L pH9.6 Na<,2>CO<,3>-NaHCO<,3>、1％BSA和4％NCS-PBS,酶標抗體和底物分別作用30min和15min時所測得的陽性OD492值相對較高,陽性OD492值與陰性OD492值之比最