新城疫病毒F基因和HN基因的克隆、表達(dá)及其ELISA抗體檢測(cè)方法的初步建立.pdf

1、新城疫（Newcastle Disease，ND）又名亞洲雞瘟，是由新城疫病毒（NDV）引起的一種多病型的高度接觸性傳染病，主要侵害雞、火雞、其它家禽和野禽類，也可感染人，是一種世界范圍內(nèi)的重要的A類傳染病，也是我國(guó)養(yǎng)雞業(yè)中幾十年來(lái)長(zhǎng)期堅(jiān)持的免疫預(yù)防的主要傳染病之一。由于新城疫的流行，給全球養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。本研究用RT-PCR方法，從新城疫病毒La Sota株基因組中克隆、鑒定了融合蛋白基因（F基因）和血凝素一神經(jīng)氨酸酶基因

2、（HN基因），并在大腸桿菌中進(jìn)行了高效表達(dá)，得到了具有免疫活性的表達(dá)產(chǎn)物。以純化的HN表達(dá)產(chǎn)物為抗原，建立了新城疫病毒抗體ELISA快速檢測(cè)技術(shù)，為雞新城疫基因工程疫苗及快速診斷試劑的研制奠定了扎實(shí)的基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)的主要研究?jī)?nèi)容包括： 1．新城疫病毒融合蛋白（F）基因和血凝素神經(jīng)氨酸酶（I-IN）基因的克隆與序列分析通過(guò)設(shè)計(jì)四對(duì)帶有BamHI和HindⅢ酶切位點(diǎn)的引物，利用RT-PCR擴(kuò)增以及亞克隆的方法，從新城疫病毒La Sot

3、a系中擴(kuò)增出F基因和HN基因，將兩種擴(kuò)增產(chǎn)物分別克隆進(jìn)pMDl8-T載體，經(jīng)限制性酶切及序列測(cè)定，結(jié)果F基因、HN基因分別為1677 bp和1734 bp，與GenBank中登錄的相應(yīng)F基因和HN基因大小一致，同源性在99％以上。 2．新城疫病毒融合蛋白（F）基因和血凝素一神經(jīng)氨酸酶（HN）基因的亞克隆及原核表達(dá)用PCR方法，獲得了缺失F蛋白信號(hào)肽、胞質(zhì)區(qū)和跨膜區(qū)的F基因以及缺失了HN蛋白胞質(zhì)區(qū)、跨膜區(qū)的HN基因，再將其亞克隆到

4、pGEX-KG中，與GST蛋白融合表達(dá)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)、SDS-PAGE分析，融合表達(dá)的蛋白分子量分別約為78 KDa和84 KDa。Western blot印跡表明兩種表達(dá)蛋白均具有較強(qiáng)的免疫學(xué)活性。 3．新城疫病毒抗體HN-ELISA快速檢測(cè)方法的初步建立用純化的HN表達(dá)蛋白為包被抗原，初步建立了檢測(cè)雞新城疫病毒血清抗體的HN-ELISA快速檢測(cè)方法。經(jīng)測(cè)定，抗原的最佳包被濃度為0．9μg／孔，被檢血清最佳稀釋度為1：80。