牛白血病病毒gp51基因的克隆、表達(dá)及ELISA抗體檢測方法的建立.pdf

1、本研究利用PCR技術(shù)，克隆了BLV gp51基因片段，并在大腸桿菌中進(jìn)行高效表達(dá)；以純化的gp51表達(dá)蛋白為包被抗原，建立了牛血清中BLV抗體的ELISA檢測方法，為BLV快速診斷試劑的研究奠定了基礎(chǔ)。主要進(jìn)行了如下試驗： 1．以FLK-BIV病毒株為研究對象，通過培養(yǎng)FLK細(xì)胞獲得大量BLV；用PCR技術(shù)擴(kuò)增BLV gp51基因，將擴(kuò)增片段克隆入pCR-Blunt載體并測序，然后用DNASTAR軟件對克隆的gp51基因進(jìn)行了分

2、析； 2．將gp51基因亞克隆入pET-32a表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化BL21(DE3)表達(dá)宿主菌，以IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，SDS-PAGE分析表達(dá)狀況，并用Western-blot檢測蛋白的免疫學(xué)反應(yīng)性；擴(kuò)大培養(yǎng)后，用不同濃度尿素溶液對包涵體進(jìn)行洗滌、溶解并透析以純化、溶解重組表達(dá)蛋白BIN-gp51，得到了純化蛋白； 3．以純化的BLV-gp51蛋白作為抗原包被酶標(biāo)板，建立血清中牛白血病病毒抗．體的間接EuSA檢測方法。方陣滴

3、定確定抗原最佳包被濃度為2.19μg/mL，最佳血清稀釋濃度為1:80，二抗最佳工作濃度為1:750；以gp51-ELISA分別檢測牛傳染性鼻氣管炎、牛病毒性腹瀉、赤羽病和藍(lán)舌病陽性血清，結(jié)果全部為陰性，表明該方法與其它牛類病原抗體無交叉反應(yīng)。用gp51-ELISA方法對172份被檢血清進(jìn)行了檢測，總陽性率達(dá)11.63％。 結(jié)果顯示： ①通過PCR法成功地擴(kuò)增了BLV gp51基因，與參考文獻(xiàn)中報道的gp51基因和氨基酸