豬嵴病毒VP1基因克隆與表達及抗體檢測ELISA方法的建立.pdf

1、豬嵴病毒(Porcine kobuvirus，PKV)是微RNA病毒科嵴病毒屬的成員，可能是導(dǎo)致豬胃腸炎的病原之一。自2007年首次發(fā)現(xiàn)以來，在全球大多數(shù)養(yǎng)豬國家陸續(xù)發(fā)現(xiàn)該病毒的感染。急性胃腸炎是導(dǎo)致幼兒、幼畜死亡的一個主要原因，雖然豬嵴病毒感染與豬胃腸炎之間的關(guān)系尚不明確，但是臨床發(fā)現(xiàn)該病毒與宿主存一定的適應(yīng)關(guān)系。研究表明，豬群各個生長階段均可感染PKV，且該病毒常與其他腸道病毒混合感染，或是其他疾病發(fā)生的誘導(dǎo)因素，其給現(xiàn)代養(yǎng)豬業(yè)帶來

2、了潛在危害。
　　豬嵴病毒尚不能在體外細胞中進行培養(yǎng)，給該病毒的相關(guān)研究工作造成一定的困難。在豬嵴病毒感染的檢測與診斷方面，主要采用RT-PCR技術(shù)直接檢測臨床樣本，血清學(xué)技術(shù)用于豬群中豬嵴病毒感染狀況的調(diào)查與分析尚未見文獻報道。因此，建立特異、敏感的血清學(xué)技術(shù)，并用于豬群中豬嵴病毒感染的血清流行病學(xué)調(diào)查是十分必要的。PKV的結(jié)構(gòu)蛋白VP1具有良好的免疫原性。本研究對VP1基因進行了克隆和原核表達，并利用表達的VP1蛋白建立了檢測

3、PKV抗體的間接ELISA方法，以期為PKV感染的血清學(xué)調(diào)查與監(jiān)測提供一種可靠的技術(shù)手段。
　　1.豬嵴病毒VP1基因的克隆與表達
　　運用分子生物學(xué)軟件DNAstar和ABCpred對豬嵴病毒XD株的VP1蛋白進行了抗原表位信息分析，結(jié)果顯示豬嵴病毒VP1蛋白的785aa-1038aa區(qū)域具有較高的抗原性和親水性。設(shè)計擴增編碼該區(qū)域基因片段的引物，應(yīng)用RT-PCR方法特異性擴增XD株VP1基因片段，將其克隆至原核表達載體，

4、成功構(gòu)建得到重組質(zhì)粒pET-32a-XDVP1，并在E.coli(DE3)中誘導(dǎo)表達。在誘導(dǎo)溫度為28℃，IPTG終濃度為0.05mmol/L，誘導(dǎo)3h的條件下可獲得高效表達的可溶性重組蛋白VP1。用大腸桿菌細菌裂解液對臨床豬血清進行吸收，去除非特異性抗體，然后再利用重組蛋白VP1進行Western blotting檢測，篩選獲得PKV陽性血清。
　　2.豬嵴病毒抗體檢測EL ISA方法的建立
　　用純化的重組蛋白VP1為包

5、被抗原建立了檢測PKV VP1抗體的間接ELISA方法，且確定了ELISA的最適工作條件。結(jié)果顯示，重組蛋白最適包被濃度為0.4μg/mL，待檢血清適宜稀釋度為1∶50，HRP-山羊抗豬IgG工作濃度為1∶4000，待檢血清和酶標二抗的反應(yīng)條件為37℃30 min，陰陽性臨界值為0.35。建立的ELISA方法具有良好的特異性，與豬流行性腹瀉病毒、傳染性胃腸炎病毒陽性血清無交叉反應(yīng)。
　　應(yīng)用建立的ELISA方法對臨床采集華北地區(qū)的