豬腦心肌炎病毒VP1蛋白B細胞表位解析及其阻斷ELISA抗體檢測方法的建立.pdf

1、腦心肌炎病毒（Encephalomyocarditisvirus，EMCV）是一種重要的人獸共患病病原。其宿主范圍十分廣泛，能感染包括人在內的多種哺乳動物、鳥類及昆蟲等。目前，豬已成為該病毒感染最普遍的動物，感染后，可引起仔豬的急性致死性心肌炎和母豬的繁殖障礙等疾病，不僅給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失，也潛在威脅著人類健康。EMCV屬于微RNA病毒科心病毒屬，是單股正鏈的RNA病毒，病毒粒子無囊膜，衣殼由VP1-VP4四種結構蛋白組成，在四種

2、結構蛋白中以VP1的抗原性最強，并可刺激機體產生中和抗體。本研究采用純化的EMCV免疫小鼠，成功獲得10株抗EMCVVP1蛋白和1株抗VP2蛋白的單克隆抗體;通過對所得單克隆抗體針對抗原表位的分析，精確定位了VP1蛋白上可能存在的5個B細胞線性表位;本研究還以重組VP1蛋白扣辣根過氧化物酶標記的VP1蛋白單抗為基礎，建立了檢測EMCV抗體的阻斷ELISA方法，為EMCV臨床診斷方法的建立和VP1蛋白相關功能的進一步研究奠定了基礎。具體研

3、究內容包括:
　　1.豬源腦心肌炎病毒單克隆抗體的制備與生物學特性鑒定
　　利用純化的豬源腦心肌炎病毒（EMCVNJ08株）經(jīng)BEI滅活后免疫BALB/c小鼠，采用雜交瘤細胞技術，共獲得11株能穩(wěn)定分泌抗EMCV抗體的雜交瘤細胞株，分別命名為1D1、2A2、2A5、2B6、4B2、4B9、4E2、4F1、5A1、5A11和5G1。經(jīng)間接ELISA測定，11株雜交瘤細胞培養(yǎng)上清效價分別為1∶1600、1∶6400、1∶3200

4、、1∶6400、1∶1600、1∶6400、1∶3200、1∶6400、1∶6400、1∶6400和1∶3200，接種小鼠的腹水效價分別為1∶1.63×106、1∶3.28×106、1∶3.28×106、1∶1.13×106、1∶1.63×106、1∶1.63×106、1∶5.63×105、1∶3.28×106、1∶1.63×106、1∶3.28×106和1∶1.63×106。單克隆抗體亞類鑒定結果顯示，1D1、2A2、2A5、4B2、

5、4B9、4F1、5A1、5A11和5G1這9株單抗的亞類為IgG1，2B6和4E2這2株單抗的亞類為IgG2b，所有單抗的輕鏈均為κ型。Westernblot鑒定結果表明1D1、2A2、2A5、4B2、4B9、4E2、4F1、5A1、5A11和5G1能特異性識別病毒的VP1蛋白，2B6能特異性識別病毒的VP2蛋白。間接免疫熒光試驗證明，11株單抗都具有良好的特異性，均能識別EMCV。本研究所獲得的單克隆抗體將為EMCV檢測方法的建立和病

6、毒結構蛋白抗原表位的分析提供技術儲備。
　　2.豬腦心肌炎病毒NJ08株VP1蛋白B細胞表位的鑒定
　　為了對實驗室已獲得的17株抗豬腦心肌炎病毒VP1蛋白的單克隆抗體所針對的抗原表位進行精確定位，本研究利用原核表達系統(tǒng)，分別表達了41個重組的截短VP1蛋白;首先經(jīng)SDS-PAGE和Westernblot鑒定目的蛋白獲得成功表達后，再通過間接ELISA和Westernblot方法精確定位了17株單克隆抗體所識別的抗原表位;結

7、果顯示，單抗6E11、7A7和7C9識別的位點是V(2)ENAEK(7)，單抗2C8識別位點A(17)DFVA(21)，單抗1D1、1F3、2A2、2A5、4B2、4B9、4F1、5A1、5A11和5G1識別的位點是F(19)VAQPVY(25)，單抗1G8和3A9識別的位點為P(42)IGAFTVK(49)，單抗4E2識別的抗原位點是F(36)YDRSSPIGAFTVKS(50)。將鑒定的5個抗原表位與16株不同來源的EMCV參考毒株

8、進行序列比對分析，結果發(fā)現(xiàn)表位A(17)DFVA(21)和F(19)VAQPVY(25)在所參考的毒株中高度保守，表位P(42)IGAFTVK(49)和F(36)YDRSSPIGAFTVKS(50)在國內EMCV分離株中十分保守，與國外各分離株相比較，在不同毒株的不同位置分別出現(xiàn)一個氨基酸的突變;表位V(2)ENAEK(7)除與GXLC分離株和三株美國分離毒株在VP1蛋白的第7個氨基酸（K7→R7）發(fā)生突變以外，與其余毒株之間完全一致。

9、以上結果豐富了EMCVVP1蛋白抗原表位圖譜，為VP1蛋白相關功能的進一步研究和EMCV診斷方法的建立奠定了基礎。
　　3.豬腦心肌炎病毒阻斷ELISA抗體檢測方法的建立與應用
　　應用純化的EMCV重組VP1蛋白和辣根過氧化物酶標記的VP1蛋白單克隆抗體建立了檢測EMCV抗體的阻斷ELISA方法。經(jīng)條件優(yōu)化，確定抗原最佳包被條件為1μg/mL的濃度，4℃包被12h;最佳封閉條件為1％BSA，37℃封閉3h;待檢血清最佳作用

10、條件為稀釋度1∶1，37℃作用2h;酶標單抗最佳作用條件為稀釋度1∶15000，37℃作用0.5h;TMB最佳顯色時間為37℃5min。通過對30份EMCV陰性血清進行阻斷ELISA檢測，結果經(jīng)統(tǒng)計學分析，確定本方法的判定標準為當阻斷率PI≥39.10％時為陽性，PI≤29.46％時為陰性，29.46％＜PI＜39.10％時為可疑。應用本方法對30份臨床血清樣品進行檢測，以EMCV血清中和試驗為標準，結果表明兩種方法的符合率為90％，且