豬腦心肌炎病毒基因組分子特征及其全長感染性cDNA克隆的構建.pdf

1、腦心肌炎病毒(Eneephalomyoearditis virus，EMCV)屬于微RNA病毒科(Picornaviridae)，心病毒屬(Cardiovirus)成員。腦心肌炎病毒感染可致母豬繁殖障礙和仔豬的高死亡率，以腦炎、心肌炎和心肌周圍炎為主要特征。本研究完成了2株我國EMCV分離毒株(BJC3和HB1)的全基因組序列測定和基因組分子特征分析，獲得了我國EMCV毒株的基因組信息數(shù)據，為EMCV的分子流行病學及分子生物學研究奠定了

2、基礎；成功構建了EMCV分離毒株BJC3的全長感染性cDNA克隆，為深入研究EMCV的分子致病與免疫機理、基因功能和新型病毒載體的構建及其新型疫苗的研制提供了必要的技術平臺。 通過設計5對引物，采用RT-PCR技術擴增EMCV分離毒株BJC3和HBl基因組完整開放閱讀框(ORF)序列，應用3'RACE和5'RACE技術擴增分離毒株的3'UTR和5'UTR，分別進行擴增片段的克隆和測序。結果表明，排除poly(A)，BJC3和HB

3、l的全基因組大小分別為773Int和7720nt，它們的基因組結構相同，全基因組核苷酸序列相似性為99.6％；具有一個長的開放閱讀框，編碼2292aa。BJC3和HB1，的poly(C)結構域中均存在C<,n>TCTC<,3>TC<,10>保守基序，BJC3的poly(C)至少由26nt組成，HB 1的poly(C)可讀序列不少于24nt。BJC3和HB1的poly(A)尾都比較短，僅15個腺嘌呤核苷。 應用分子生物學軟件對BJ

4、C3和HB1全基因組核苷酸及推導氨基酸序列進行了序列比對和同源性分析。結果表明，2個分離毒株基因組核苷酸的變異程度不大，核苷酸變異散在分布于基因組的各個編碼區(qū)，BJC3和HB1與其它EMCV參考毒株全基因組核苷酸序列同源性介于83.6％～99.9％，與CBNU的全基因組核苷酸序列同源性最高，分別為99.9％和99.7％；與EMC-B全基因組核苷酸序列同源性最低，均為83.6％。BJC3和HB1與Mengo病毒全基因組核苷酸序列同源性均為

5、81.3％。BJC3和HB1的VP1核苷酸序列同源性為99.5％，BJC3 VP1核苷酸序列與其它EMCV參考株的同源性介于81.5％～99.5％。BJC3、HB1、BEL-2887A/91和CBNU的VP4、VP2、2B和3B氨基酸序列高度保守，同源性均為100％。BJC3和HB1 VP1蛋白有2個潛在的N-糖基化基序，分別為N<,29>QT和N<,62>GT，VP1是表位最多的區(qū)域，預測有9個可能的表位；位于VP3“莖-環(huán)”結構處的

6、表位基序T<,17>LPDST和E<,40>YKDFL及VP1的P<,27>ENQTK可能是EMCV的中和表位。基于EMCV完整ORF推導氨基酸序列繪制的系統(tǒng)進化樹結果表明，BJC3和HB1在相同的進化分支上，它們與歐洲流行毒株BEL-2887A/91的進化關系較近，可能有共同的起源。 依據BJC3全基因組序列，設計2對引物擴增其5'半長cDNA和3'半長cDNA，依次連接至低拷貝質粒pWSK29，構建出BJC3全長cDNA克隆

7、(pWSKBJC3/W)。經測序顯示，該全長質粒5'末端成功引入SP6原核啟動子，3'末端poly(A)長度22nt，poly(C)長度為25nt。pWSKBJC3/W全長質粒經Not Ⅰ酶切線化、體外轉錄，得到具有感染性EMCV RNA，經脂質體DMRIE-C轉染BHK-21細胞，36h收獲培養(yǎng)上清，連續(xù)傳3代，細胞出現(xiàn)CPE。經RT-PCR和間接免疫熒光鑒定，證實獲得具有感染性的恢復病毒，命名rBJC3/SP6。第5代恢復病毒rBJ