戊型肝炎病毒SAAS-JDY5株基因組全長(zhǎng)cDNA的構(gòu)建及其改造.pdf

1、戊型肝炎（Hepatitis E，HE）是由戊型肝炎病毒（Hepatitis E virus，HEV）引起的急性病毒性疾病，該病屬于人畜共患病，對(duì)人類(lèi)健康具有很大的危害。戊型肝炎病毒屬于肝炎病毒科（Hepeviridae Family）肝炎病毒屬（Hepevirus），為單股正鏈RNA病毒，基因組全長(zhǎng)約7.2kb，具有3個(gè)互相重疊的開(kāi)放讀碼框架（Open reading frame，ORF），自病毒基因組的5'末端到3'末端依次排列著非

2、編碼區(qū)（UTR）、ORF1、ORF3和ORF2。3'端非編碼區(qū)是由腺嘌呤核苷酸組成的多聚腺苷酸尾（polyA），其中ORF3與ORF1、ORF2部分重疊，或完全包含在ORF2中。ORE1為非結(jié)構(gòu)區(qū)基因，主要編碼非結(jié)構(gòu)蛋白；ORF2編碼病毒的衣殼蛋白；ORF3編碼功能未知的蛋白。
　　 目前戊型肝炎尚無(wú)有效的治療方法，唯一可行的是預(yù)防。因此，戊型肝炎疫苗的研制受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。對(duì)于戊肝的防治至今尚無(wú)商品化疫苗，多種基于DN

3、A重組技術(shù)的戊肝候選疫苗也處于研制階段。HEV感染性cDNA克隆以及細(xì)胞感染模型的建立對(duì)戊肝抗病毒研究和減毒活疫苗研究將有很大的幫助。
　　 基于以上分析，本研究利用分子生物學(xué)和反向遺傳學(xué)的技術(shù)和手段對(duì)本實(shí)驗(yàn)室自行分離得到的3型戊型肝炎病毒SAAS-JDY5株進(jìn)行基因組全長(zhǎng)cDNA克隆的構(gòu)建。實(shí)驗(yàn)主要包括三個(gè)部分，首先用重疊延伸per（overlap pcr）的方法把實(shí)驗(yàn)室已有的9個(gè)包含了HEV SAAS-JDY5株全部基因組信

4、息的片段連成4段；接下來(lái)結(jié)合In-fusion技術(shù)和以限制性?xún)?nèi)切酶、連接酶為基礎(chǔ)的DNA重組技術(shù)把這4段連成基因組全長(zhǎng)cDNA；最后為了保證全長(zhǎng)cDNA克隆具有感染性，又用In-fusion技術(shù)對(duì)它進(jìn)行了改造。
　　 Overlap per的原理：設(shè)計(jì)具有互補(bǔ)末端的引物，使PCR產(chǎn)物形成重疊鏈，從而在隨后的擴(kuò)增反應(yīng)中通過(guò)重疊鏈的延伸，將不同來(lái)源的擴(kuò)增片段重疊拼接起來(lái)。本實(shí)驗(yàn)室已獲得SAAS-JDY5株HEV的全基因組序列和9個(gè)包

5、含了HEV全部基因組信息的片段，并且相鄰的片段之間都有一段重復(fù)序列，符合了overlap per的條件，所以首先想到的是用overlap pcr法連接這9個(gè)小片段。以相鄰的兩段為模板，第一段的上游引物和第二段的下游引物為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，就把兩個(gè)片段連接起來(lái)，得到新的長(zhǎng)片段。重復(fù)上述操作直到把9個(gè)小片段連成4個(gè)2kb左右的長(zhǎng)片段（1～2474，2094～4664，4340～6645，5186～7232）。此方法在操作過(guò)程中需注意兩個(gè)模

6、板的濃度和比例，最好保證摩爾比為1比1，而且濃度不能太低；另外退火溫度也需摸索，overlap pcr的退火過(guò)程中不僅僅有引物和模板的結(jié)合，還有兩段模板之間重復(fù)序列的結(jié)合，是整個(gè)過(guò)程的關(guān)鍵，因此需要反復(fù)摸索直到確定一個(gè)最佳退火溫度。由于是雙模板，比普通PCR難度要大，片段太長(zhǎng)不容易擴(kuò)增出來(lái)，而且保真性也不好，所以只用這個(gè)方法連出大小為2kb左右的片段，后續(xù)的研究用傳統(tǒng)的內(nèi)切酶消化和連接酶處理以及In-fusion法。
　　 傳統(tǒng)

7、的以限制性?xún)?nèi)切酶和連接酶為基礎(chǔ)的DNA重組技術(shù)曾經(jīng)革命性地推動(dòng)了分子生物學(xué)和遺傳工程的發(fā)展，至今仍然發(fā)揮著重要作用。但是實(shí)驗(yàn)室原有的片段太多，找酶切位點(diǎn)比較困難。用overlap pcr連成4個(gè)長(zhǎng)片段后就相對(duì)容易一些，利用4626位置上的KpnⅠ和載體上的XbaⅠ這兩個(gè)酶切位點(diǎn)將中間兩段連接，從而形成3個(gè)大片段（1～2474，2094～6645，5186～7232）。In-fusion法的原理跟基因同源重組類(lèi)似，利用DNA片段的同源關(guān)系

8、將目的片段定向地插入載體中。這個(gè)方法只需一個(gè)單一的酶切位點(diǎn)將載體線性化即可，不需要兩個(gè)單一的酶切位點(diǎn)，條件沒(méi)有前面苛刻，所以結(jié)合這個(gè)方法用于最后兩步連接。先利用載體上的XbaⅠ酶切位點(diǎn)將前兩段連接（1～5318），然后利用5245位置上的FseⅠ酶切位點(diǎn)將最后兩段連成HEV的全長(zhǎng)cDNA。In-fusion法需要重新設(shè)計(jì)引物，使目的基因的兩端帶有載體兩端的同源序列。雖然也涉及到PCR過(guò)程，但是以質(zhì)粒為模板，難度相對(duì)overlap pcr

9、要小，可以擴(kuò)增3kb左右大小的片段用于連接。
　　 為了進(jìn)一步保證這個(gè)HEV的全長(zhǎng)cDNA克隆具有感染性，又對(duì)它進(jìn)行了修正。在測(cè)序之后發(fā)現(xiàn)5’端有94個(gè)堿基與原序列比對(duì)不上，另外在2467的位置多出了5個(gè)堿基，我們需要將這一段替換掉。為了保證序列的準(zhǔn)確性，重新從病料中提取SAAS-JDY5株的RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄（RT-PCR）。設(shè)計(jì)套式特異性引物，并在5’端引入T7 RNA聚合酶啟動(dòng)子，進(jìn)行巢式PCR（Nest-PCR）擴(kuò)增出目