基因4型豬戊型肝炎病毒SASAS-FX17株感染性克隆的構(gòu)建.pdf

1、戊型肝炎(hepatitis E，HE)是由戊型肝炎病毒（hepatitis E virus，HEV）引起的一種經(jīng)糞，口途徑傳播的疾病，是一種人畜共患病。戊型肝炎病毒主要侵犯青壯年和孕婦，尤其是孕婦易造成流產(chǎn)、死胎及死亡。長(zhǎng)期以來由于缺乏有效的體外細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，影響了對(duì)HEV復(fù)制機(jī)理和致病機(jī)制等方面的研究。而隨著反向遺傳學(xué)的發(fā)展，利用相關(guān)技術(shù)將病毒RNA轉(zhuǎn)換為cDNA，從而可以在DNA分子水平上對(duì)RNA病毒進(jìn)行研究。
　　 反向

2、遺傳學(xué)的核心是構(gòu)建病毒感染性克隆，因此本試驗(yàn)在已知HEV SAAS-FX17全基因組序列的基礎(chǔ)上構(gòu)建了病毒全基因組cDNA分子克隆并進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)驗(yàn)證其具有感染性。
　　 首先構(gòu)建HEV全基因組cDNA分子克隆。我們利用基因4型豬HEV SAAS-FX17株全基因組序列中4個(gè)單一酶切位點(diǎn)，分別是BamHⅠ、SanDⅠ、HindⅢ、BglⅡ，分5段克隆了HEV的基因組序列。為使克隆的全基因組能插入到合適的載體中，在HEV全基因組的5

3、'端和3'端分別引入SpeⅠ、XbaⅠ酶切位點(diǎn)序列;為使構(gòu)建的全基因組cDNA可以體外轉(zhuǎn)錄，我們?cè)贖EV的5'端SpeⅠ酶切序列后加上T7啟動(dòng)子核心序列。將擴(kuò)增片段連接到p JET1.2 Blunt載體上篩選陽(yáng)性重組質(zhì)粒，測(cè)序正確的質(zhì)粒保存?zhèn)溆?。為了方?個(gè)HEV片段插入克隆載體，我們利用PCR技術(shù)對(duì)克隆載體pGEM-9Z進(jìn)行改造，將其多克隆位點(diǎn)替換為SpeⅠ、BamHⅠ、SanDⅠ、HindⅢ、BglⅡ、XbaⅠ酶切序列，命名為pGE

4、M-9Z-Stuffer。依次將5個(gè)HEV片段插入到pGEM-9Z-Stuffer載體中，得到HEV全基因組cDNA克隆pGEM-9Z-HEV。
　　 以線性化的pGEM-9Z-HEV為模板，體外轉(zhuǎn)錄合成RNA并多點(diǎn)注射到SD大鼠肝臟內(nèi)。試驗(yàn)組每只注射200μL RNA，對(duì)照組注射等量無菌PBS，觀察52天，定期采集樣品檢測(cè)糞便中HEV、血清中HEV抗體的變化。檢測(cè)糞便中HEV RNA結(jié)果顯示試驗(yàn)組3#、4#大鼠在感染后第23天

5、首先檢測(cè)到HEV RNA，在第30天所有大鼠糞便內(nèi)均能檢測(cè)到HEV RNA，并可持續(xù)至第45天。在第52天僅有1#大鼠糞便中能檢測(cè)到HEV RNA。通過對(duì)遺傳標(biāo)記的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性大鼠糞便中檢測(cè)到的HEV基因組中均存在遺傳標(biāo)志，說明拯救的病毒來自人工構(gòu)建而非野生毒株的污染。血清中HEV抗體檢測(cè)結(jié)果顯示3#、4#和5#大鼠HEV抗體在第31天最先陽(yáng)轉(zhuǎn)，在第38天抗體濃度達(dá)到峰值。而1#、2#最晚，在第38天抗體才開始陽(yáng)轉(zhuǎn)，在第45天達(dá)到峰值。