豬繁殖與呼吸綜合征病毒BJ-4株感染性分子克隆的構(gòu)建.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的一種以母豬繁殖障礙和仔豬呼吸道疾病為特征的傳染病,給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失.該研究利用反向遺傳學(xué)操作技術(shù),構(gòu)建了PRRSV BJ-4株的全長cDNA克隆,并對全長cDNA克隆中存在的23個突變位點進(jìn)行了回復(fù)突變,繼而對突變后的全長cDNA克隆體外轉(zhuǎn)錄體的感染性進(jìn)行了研

2、究.為將來實現(xiàn)的DNA水平上對PRRSV基因組的人工操作,從而在分子水平上研究PRRSV的復(fù)制和致病機(jī)理、基因產(chǎn)物的功能等提供技術(shù)手段,并為構(gòu)建新型的病毒載體和發(fā)展安全有效的活病毒疫苗奠定基礎(chǔ).依據(jù)PRRSV BJ-4株全基因組序列,分6段設(shè)計引物,覆蓋PRRSV基因組的cDNA重疊片段A1、A2、B1、B2、C和D的預(yù)期大小分別為1,294bp、3,452bp、3,376bp、1,823bp、3,484bp和2,887bp.通過優(yōu)化R

3、T-PCR反應(yīng)條件,最終擴(kuò)增出其全基因組cDNA片段.并將它們分別克隆入pGEM-T Easy載體或pBluescript SK+載體.然后將獲得的6個克隆依次連接并克隆到低拷貝質(zhì)粒載體pWSK29中,獲得該毒株全長cDNA克隆pWSK DCBA.在全長cDNA克隆的兩端和中間引入了病毒序列中不存在的單酶切位點,并在序列的5'端引入了SP6 RNA聚合酶啟動子序列以及一個外源的"G",在3'端引入了poly(T)<,83>序列.對擴(kuò)增出

4、的覆蓋PRRSV全基因組cDNA的6個片段分別進(jìn)行序列測定,并與其原始病毒BJ-4株以及其它GenBank中已有的PRRSV序列進(jìn)行比對,發(fā)現(xiàn)其中存在23個堿基的變異.用定向點突變方法,對這些堿基進(jìn)行了回復(fù)突變,得到包含PRRSV各cDNA重疊片段的6個克隆,經(jīng)序列測定證實,這6個克隆在成功恢復(fù)23個變異堿基的同時,未引入新的突變.將它們依次連接并克隆到低拷貝質(zhì)粒載體pWSK29中,獲得了該毒株定點突變后的全長cDNA克隆P1P2mP3

5、P4-63.將病毒的全長cDNA克隆P1P2mP3P4-63大量培養(yǎng)后,按低拷貝質(zhì)粒提取方法提取質(zhì)粒,用限制性內(nèi)切酶Sph I酶切線性化后,作為體外轉(zhuǎn)錄模板.轉(zhuǎn)錄出的RNA用DNase I消化模板質(zhì)粒DNA,再經(jīng)脂質(zhì)體DMRIE-C轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后24h的培養(yǎng)上清接種Marc-145細(xì)胞后,連續(xù)培養(yǎng)3代,在傳至第2代時能產(chǎn)生典型的細(xì)胞病變.經(jīng)RT-PCR和間接免疫熒光鑒定,證實獲得了有感染性的恢復(fù)病毒,表明成功地構(gòu)建出了具有