豬繁殖與呼吸綜合征病毒BJ-4株GP5單克隆抗體的研制.pdf

1、該研究用純化的豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)的重組GP5蛋白,成功制備出4株針對(duì)GP5蛋白的單克隆抗體,并對(duì)單克隆抗體的特性進(jìn)行了鑒定和分析.GP5系列表位單克隆抗體的研制,有利于開展GP5抗原表位的定位分析.同時(shí),結(jié)合ORF5的遺傳演化分析,有利于闡明GP5在PRRSV感染中的免疫學(xué)功能.pGEX-4T-dORF5重組融合蛋白經(jīng)親和層析純化后作為免疫抗原免疫8周齡Balb/c小鼠,第一次免疫用抗原加等量弗氏完全佐劑背部皮下多點(diǎn)注

2、射,然后兩次用抗原加等量弗氏不完全佐劑同法免疫,免疫劑量為100μg/只,融合前三天做加強(qiáng)免疫,用不加佐劑抗原腹腔注射,劑量為100μg/只.獲得免疫脾細(xì)胞,采用細(xì)胞融合技術(shù)與鼠源SP2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合.用部分純化的pET32a-ORF5重組融合蛋白作為包被抗原建立間接ELISA方法篩選陽性雜交瘤,建立重組結(jié)構(gòu)蛋白GP2間接ELISA方法,對(duì)重組GP5間接ELISA方法篩選出的陽性上清進(jìn)行再次檢測(cè),淘汰假陽性孔.選擇強(qiáng)陽性孔,采用

3、有限稀釋法進(jìn)行亞克隆,獲得4株穩(wěn)定分泌抗GP5單抗的雜交瘤細(xì)胞系,分別命名為B6A3、B6A4、F12F10和B11F11B2.經(jīng)間接ELISA檢測(cè),結(jié)果表明B6A3和B6A4效價(jià)達(dá)到1:320000,F12F10和B11F11B2效價(jià)在1:320000以上.對(duì)單抗進(jìn)行亞類鑒定結(jié)果表明,所獲得的4株單抗都為IgG2a亞類,輕鏈為κ型.免疫印跡試驗(yàn)表明,單抗B6A3、F12F10能與重組GP5產(chǎn)生反應(yīng).制備PRRSV細(xì)胞培養(yǎng)單層,間接免疫

4、熒光抗體試驗(yàn)表明,B6A3、F12F10能與全病毒反應(yīng),產(chǎn)生特異性熒光.選擇B6A3在HS.2H細(xì)胞系上進(jìn)行病毒中和試驗(yàn),結(jié)果表明該株單抗中和活性為可疑.把各株單抗分別作1:80000和1:160000稀釋,B6A3和F12F10,B6A3和B11F11B2,F12F10和B11F11B2混合進(jìn)行間接ELISA檢測(cè)時(shí),OD450nm值比其中任何一種單抗單獨(dú)測(cè)定時(shí)的OD450nm值高.推測(cè),B6A3和F12F10,B6A3和B11F11B