高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5和N蛋白單克隆抗體的制備及新型亞單位疫苗研究.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的一種以妊娠母豬嚴重繁殖障礙以及仔豬的呼吸道癥狀和高死亡率為特征的傳染病。該病于1987年首次報道于美國,現(xiàn)已遍布全世界,給各國的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的危害。而近幾年在我國出現(xiàn)了高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒的暴發(fā)與流行,給我國養(yǎng)豬業(yè)幾乎造成了毀滅性的打擊。
　　 由ORF5基因編碼的GP5是PRRSV最主要的免疫原性蛋白,能誘發(fā)機體產(chǎn)生中和抗體,但由于誘騙表

2、位A對中和表位B的覆蓋效應(yīng),現(xiàn)有的基于天然ORF5基因構(gòu)建的多種疫苗均難以產(chǎn)生較早和較高的中和抗體,但對ORF5基因進行適當(dāng)?shù)男揎?可以增強GP5的免疫原性。由ORF7編碼的N蛋白是PRRSV高度保守的結(jié)構(gòu)蛋白,也具有極強的免疫原性。PRRSV感染豬后,最早產(chǎn)生的就是針對N蛋白的抗體,且持續(xù)時間極長,因此N蛋白是目前公認最適合作PRRS診斷用的靶標(biāo)。
　　 近年來,植物病毒及其編碼的蛋白作為新型動物疫苗的載體受到格外的關(guān)注。許多

3、植物病毒的衣殼蛋白可以在體外自我組裝成病毒樣顆粒(VLPs),將外源肽展示在病毒粒子表面后具有很好的免疫原性,能夠誘導(dǎo)機體產(chǎn)生特異性抗體,可以作為新型疫苗研究的重要平臺。
　　 本研究針對高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒,開展了GP5蛋白和N蛋白單克隆抗體的制備,同時,以植物病毒衣殼蛋白為載體,探討了PRRS新型亞單位疫苗。主要研究內(nèi)容包括:
　　 1.抗GP5單克隆抗體的制備
　　 以PRRSV WUH3株基因組

4、RNA為摸板,RT-PCR擴增獲得截去信號肽的ORF5基因cDNA片段,片段大小約為540bp。BamHI和XhoI酶切后克隆到載體pGEX-KG構(gòu)建原核表達質(zhì)粒pKG-ORF5。在大腸桿菌中表達后提取包涵體免疫小鼠,制備單抗。經(jīng)ELISA篩選和Western blot驗證,最終得到三株單抗,分別為2G8、3G8、1F12。三株單克隆抗體的小鼠腹水效價均達到100×28。
　　 2.抗N蛋白單克隆抗體的制備
　　 用Ba

5、mHI和HindⅢ分別雙酶切pET-30a和pGEX-KG-ORF7,回收連接,構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pET-30a-ORF7。原核表達后純化蛋白免疫小鼠,制備單抗,經(jīng)ELISA篩選獲得8株雜交瘤細胞,分別為:1A2、1D9、1F6、2C7、389、3H2、4D2和4E2。其中除1D9和4E2外,其余6株用真核表達的N蛋白作抗原經(jīng)Western驗證結(jié)果均為陽性。小鼠腹水效價均為100×29。
　　 3.番木瓜花葉病毒農(nóng)殼蛋白介導(dǎo)的PR

6、RSV亞單位疫苗研究
　　 針對高致病性PRRSV WUH3株ORF5基因的特征,選取去除了信號肽但包含有中和表位B和覆蓋表位A的GP5 N端第26-66aa片段,將輔助性T淋巴細胞表位(PADRE)的核苷酸序列插入ORF5的中和表位和覆蓋表位之間,將中和表位兩端的糖基化位點(N30、N34、N35和N51)消除,同時用中和表位替換覆蓋表位,并對ORF5基因密碼子進行優(yōu)化,以期達到充分暴露中和抗體表位,誘發(fā)機體更強免疫應(yīng)答的目的