豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP4白單克隆抗體制備與抗原表位篩選.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)屬于套式病毒目（Nidovirales）動(dòng)脈炎病毒科（Arteriviridae）動(dòng)脈炎病毒屬（Arterivirus），臨床感染主要表現(xiàn)為發(fā)熱，早產(chǎn)，流產(chǎn)，死胎和木乃伊胎等豬群的繁殖障礙和呼吸道癥狀。GP4蛋白是病毒粒子囊膜的組成部分，是該病毒的次要結(jié)構(gòu)蛋白之一，是由ORF4基因編碼的糖基化蛋白，

2、少量存在病毒粒子中，由183或178個(gè)氨基酸殘基組成，有4個(gè)糖基化位點(diǎn)，GP4能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，而且在細(xì)胞受體識(shí)別病毒粒子以及在病毒變異等方面具有重要意義。噬菌體展示技術(shù)研究抗原表位不僅可以證明抗原分子的具體結(jié)構(gòu)與功能，還可以揭示抗原抗體的反應(yīng)機(jī)制，已廣泛用于研發(fā)多種多肽疫苗和新型藥物。本實(shí)驗(yàn)以PRRSV-HUN4株為研究對(duì)象，制備了其GP4蛋白單克隆抗體并對(duì)其抗原表位進(jìn)行了篩選和初步研究。
　　本實(shí)驗(yàn)以原核表達(dá)的PRRS

3、V GP4蛋白為免疫原免疫Balb/C小鼠，通過(guò)常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)胞融合，3輪亞克隆后，成功篩選出1株抗PRRSV GP4蛋白的單克隆抗體，經(jīng)亞類鑒定為IgG2b型，該株抗體的穩(wěn)定性與特異性較好，不僅能夠與重組GP4蛋白反應(yīng)，而且能夠與PRRSV有良好的反應(yīng)性。
　　應(yīng)用噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)對(duì)制備成功的5F12單抗進(jìn)行4輪生物淘選，得到10株陽(yáng)性噬菌體，測(cè)序后結(jié)果為:10個(gè)噬菌體中有4個(gè)氨基酸序列相同，其12肽序列分別為AKFEVCSPVV

4、LG、GVNQENMLHFSF、NPRIRLNFIRIG和SGVYKVAYDWQH，命名為phage-Ⅰ-Ⅳ。序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)phage-Ⅰ和Ⅱ的12肽序列分別與PRRSV HuN4株GP4蛋白第112至123位和第84至95位氨基酸序列具有很高的相似性。噬菌體競(jìng)爭(zhēng)抑制試驗(yàn)與ELISA方法證實(shí)篩選出的親和噬菌體與PRRSV及其GP4蛋白有很高的反應(yīng)性，可以用于檢測(cè)PRRSV及相關(guān)表位疫苗的研究，這為PRRSV病毒特性及其臨床防治研究奠定理論