豬繁殖與呼吸綜合征病毒N蛋白原核表達及單克隆抗體的研制.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征( porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是規(guī)?；i場引發(fā)的主要疫病之一，病原是豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)。該病毒屬于尼多病毒目( Nidovirales)，動脈炎病毒科(Arterivirus)成員。PRRSV基因組全長約為15kb，包含9個

2、開放閱讀框(ORFs)，分別編碼RNA依賴的RNA聚合酶(RdRp)和7個結(jié)構(gòu)蛋白GP2a、GP2b、GP3、GP4、GP5、M和N蛋白。其中，N蛋白抗原性最強，PRRSV感染后機體首先產(chǎn)生的是針對N蛋白的抗體，并且在體內(nèi)持續(xù)時間最長，因而該蛋白已被作為檢測PRRSV血清抗體的診斷抗原。本研究通過原核表達質(zhì)粒表達的蛋白和純化的PRRSV SY00608毒株病毒免疫小鼠，成功制備了抗PRRSV N蛋白的單克隆抗體，主要內(nèi)容包括：
　

3、　 1.PRRSV SY0608 N基因在大腸桿菌中的表達：以含有PRRSV N基因的pMD18T-SY11155-14254重組質(zhì)粒為模板，參照已發(fā)表的PRRSV基因組序列，設(shè)計一對PCR引物，并在其上下游分別添加BamHI和HindⅢ酶切位點。獲得的PCR產(chǎn)物用BamHHI和HindⅢ酶切后與經(jīng)同樣處理的pRSET-A原核表達載體質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)化DH5α細胞后挑取陽性克隆。經(jīng)酶切鑒定和測序驗證后，轉(zhuǎn)化至E.coliBL21中，用0.

4、6mM異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)于37℃誘導(dǎo)表達4h后，取細菌菌體用SDS-PAGE分析。結(jié)果表明，N-SY在大腸桿菌中得到表達，重組蛋白大小約為17kDa。將表達的6×HIS-N-SY蛋白用親和層析法進行純化，用豬抗PRRSV血清抗體進行Western blot鑒定，結(jié)果表明，融合表達的N-SY蛋白能被PRRSV陽性血清特異性識別。
　　 2.PRRSV N蛋白單克隆抗體的制備：取純化的PRRSV SY0608毒

5、株重組N蛋白(HIS-N-SY)和純化的PRRSV SY0608病毒按每只50-100μg的劑量與等量弗氏完全佐劑進行乳化，分別皮下多點注射免疫6-8周齡BALB/c小鼠。每間隔2w再用弗氏不完全佐劑乳化的重組蛋白加強免疫2次，并于融合前3d進行腹腔注射加強免疫1次。取脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞進行融合，其中，用純化HIS-N-SY蛋白免疫的小鼠的脾細胞與SP2/0細胞的融合率為80％，首次篩選陽性率達60％，經(jīng)過3次亞克隆，獲得1株

6、能穩(wěn)定分泌抗N蛋白抗體的雜交瘤細胞株2H7;用純化PRRSV SY0608全病毒免疫的小鼠的脾細胞與SP2/0細胞的融合率為90％，首次篩選陽性率為40％，經(jīng)過3次亞克隆，獲得2株能穩(wěn)定分泌抗N蛋白抗體的雜交瘤細胞株，將其命名為4A11和1G9。單抗2H7亞型鑒定結(jié)果為IgG1型，其輕鏈為κ鏈。間接免疫熒光試驗證明，2H7、4A11和1G9均能與PRRSVS1和SY0608毒株產(chǎn)生特異性反應(yīng)。Western blot試驗結(jié)果表明這3株單