豬繁殖與呼吸綜合征病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NSP2原核表達與單克隆抗體的研制.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndromevirus，PRRSV)屬動脈炎病毒科成員，可引起懷孕母豬繁殖障礙和仔豬呼吸道癥狀。PRRSV基因組為單股正鏈RNA，大小約15kb，含有8個開放閱讀框(ORFs)。ORF1編碼的聚合蛋白裂解產(chǎn)生13個非結(jié)構(gòu)蛋白(NSP1-13)，NSP2有多個B細胞表位，具有較強的免疫原性，病毒感染后能夠刺激機體產(chǎn)生特異性抗體。本實驗通過

2、基因重組技術(shù)將截短修飾過的NSP2基因克隆至原核表達載體中進行表達，表達出的蛋白經(jīng)過純化及鑒定后免疫Balb/C小鼠，通過細胞融合技術(shù)獲得了兩株單克隆抗體，主要內(nèi)容包括： 1.PRRSV NSP2基因在大腸桿菌中的表達：以含有PRRSV NSP2基因的pET-NSP2重組質(zhì)粒為模板，參照已發(fā)表的PRRSV基因組序列，設(shè)計一對PCR引物，并在其上下游分別添加EcoRI和NotI酶切位點。獲得的PCR產(chǎn)物用EcoRI和NotI酶切后

3、與經(jīng)同樣處理的pGEX-6p-1原核表達載體質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)化DH5a細胞后挑取陽性克隆。經(jīng)酶切鑒定和測序驗證后，轉(zhuǎn)化至E.coli BL21中，用0.6mM異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)于37℃誘導(dǎo)表達4h后，取細菌菌體用SDS-PAGE分析。結(jié)果表明，NSP2在-大腸桿菌中得到表達，重組蛋白大小約為50kDa。將表達出來的NSP2蛋白用親和層析法進行純化，用豬抗PRRSV血清抗體進行Westernblot鑒定，結(jié)果表明，融合表

4、達的GST-tNSP2蛋白能被PRRSV陽性血清特異性識別。 2.PRRSV NSP2蛋白單克隆抗體的制備：取純化的GST-tNSP2蛋白按每只50μg的劑量與等量弗氏完全佐劑進行乳化，經(jīng)皮下多點注射免疫6-8周齡Balb/c小鼠.每間隔2w再用弗氏不完全佐劑乳化的重組蛋白加強免疫2次，并于融合前3d用純化的GST-tNSP2蛋白免疫1次。取脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞進行融合，融合率達到80％,首次篩選陽性率達60％,經(jīng)過3次

5、亞克隆，獲得2株能穩(wěn)定分泌抗NSP2蛋白抗體的雜交瘤細胞株，將其命名為285、3H3。亞型鑒定結(jié)果均為IgG1型，其輕鏈均為κ鏈。間接免疫熒光試驗證明，285和3H3均能與PRRSV S1毒株產(chǎn)生特異性反應(yīng)，而不能與SY0608毒株反應(yīng)。采用間接ELISA法測得285細胞培養(yǎng)上清抗體效價為1:512，腹水效價為1:102400；3H3細胞培養(yǎng)上清為1:640，腹水效價為1:204800。將雜交瘤細胞株連續(xù)培養(yǎng)60d，傳代20次，分別取第