豬繁殖與呼吸綜合征病毒N蛋白原核表達(dá)及抗體間接ELISA檢測(cè)方法的初步建立.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征病毒 (Porcine reproductive and resDiratory syrldromeVirus,PRRSV)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新的病毒，引起豬的繁殖和呼吸系統(tǒng)癥狀。該病以繁殖母豬發(fā)熱、厭食和流產(chǎn)、木乃伊胎、弱仔等繁殖障礙以及仔豬的呼吸道癥狀和高死亡率為特征。而且該病通過胎盤、空氣等多種途徑傳播，所以對(duì)PRRSv的檢測(cè)及預(yù)防尤為重要，建立一種快速高效的診斷方法對(duì)于PRRSV的控制具有重大意義。本試驗(yàn)主要進(jìn)

2、行了如下研究。 將美洲型VR 2332株細(xì)胞毒提取總RNA，根據(jù)GenBank上的參考序列設(shè)計(jì)了一對(duì)擴(kuò)增豬藍(lán)耳N基因的特異性引物，在引物的上下游分別帶有BamHI、Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)。通過RT-PCR獲得長(zhǎng)約372bp的目的片段。將其克隆到pMD18-T載體，獲得重組質(zhì)粒pMD-N。用棚同的限制性內(nèi)切酶酶切陽性質(zhì)粒pMD-N和表達(dá)載體pET-32a后構(gòu)建重組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化宿主菌BL21，經(jīng)酶切及PCR鑒定篩選出陽性克隆，測(cè)序證

3、明目的基因以正確的閱讀框插入了表達(dá)載體，用0.1mol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)N蛋白主要抗原區(qū)，再以28℃繼續(xù)培養(yǎng)5 h，收集菌液進(jìn)行SDS-PAGE電泳，原核表達(dá)產(chǎn)物大小約為34 kDa。這樣的培養(yǎng)條件下表達(dá)量最大，經(jīng)分析表達(dá)蛋白量約占菌體蛋白的20.1％。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Western-blotting分析，能被豬繁殖與呼吸綜合征高免血清所識(shí)別。試驗(yàn)結(jié)果表明豬繁殖與呼吸綜合征病毒核衣殼蛋白抗原區(qū)在大腸桿菌中高效表達(dá)且表達(dá)產(chǎn)物具有抗原性。

4、 目的 蛋白經(jīng)大量誘導(dǎo)表達(dá)，可溶性試驗(yàn)證明重組蛋白部分以可溶性形式存在于誘導(dǎo)菌液上清中，本實(shí)驗(yàn)用鎳柱親和層析法從上清中純化了目的蛋白。純化后的目的蛋白作為抗原包被聚乙烯微量反應(yīng)板，初步建立檢測(cè)PRRSV抗體的間接ELISA診斷方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：抗原的最適包被濃度為51.7μg/mL，血清最適稀釋度為1：50，最佳血清反應(yīng)時(shí)間確定為37℃ 15min，二抗反應(yīng)時(shí)間確定為37℃10min，底物顯色液的最佳反應(yīng)時(shí)間為5 min。