豬繁殖與呼吸綜合征病毒N蛋白的遺傳變異分析及間接ELISA檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory SyndromeVirus PRRSV)引起的一種以母豬繁殖障礙和仔豬呼吸道疾病為特征的傳染病.我國(guó)1996年才報(bào)道有PRRS流行，目前流行的范圍日益擴(kuò)大，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)構(gòu)成了嚴(yán)重威脅.快速、特異且敏感的診斷方法對(duì)本病的控

2、制已成為迫切需要.PRRSV為正鏈的單股RNA病毒，基因組長(zhǎng)15kb，含有8個(gè)開(kāi)放閱讀框.核衣殼蛋白N蛋白由ORF7基因編碼，該蛋白在全病毒中含量最高，免疫原性最強(qiáng)，是病毒感染后最早誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性非中和抗體的蛋白.因此，PRRSV N蛋白在病毒的早期診斷和致病免疫機(jī)理研究中具有重要意義.本研究對(duì)GenBank中登錄的PRRSV中國(guó)大陸分離株的N蛋白進(jìn)行了遺傳變異分析，在此基礎(chǔ)上，利用原核表達(dá)系統(tǒng)對(duì)我國(guó)優(yōu)勢(shì)流行毒株ORF7基因進(jìn)行了高效可

3、溶性表達(dá)，并用重組的N蛋白作為抗原，建立了檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體的間接ELISA方法.主要研究?jī)?nèi)容包括:
　　 1 PRRSV中國(guó)大陸分離株的N蛋白的遺傳變異分析
　　 選取GenBank中登錄的PRRSV中國(guó)大陸分離株的N蛋白進(jìn)行了氨基酸序列分析和進(jìn)化樹(shù)分析，結(jié)果表明中國(guó)大陸所有已登錄的256株P(guān)RRSV分離株分為歐洲型和美洲型兩個(gè)基因型，大多數(shù)為美洲型毒株，其又可以分為4個(gè)不同的亞型;序列比對(duì)分析表明，各亞型

4、毒株的氨基酸位點(diǎn)發(fā)生了特征性的突變，且N蛋白中的抗原表位也存在氨基酸的置換，表明我國(guó)PRRSVN蛋白存在遺傳多樣性的特點(diǎn).
　　 2我國(guó)優(yōu)勢(shì)流行毒株N蛋白的原核表達(dá)
　　 針對(duì)我國(guó)優(yōu)勢(shì)流行毒株ORF7基因序列，設(shè)計(jì)了特異性引物，對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增與克隆，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-N.將重組質(zhì)粒pET-28a-N導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，結(jié)果表達(dá)出大小約為22kDa的重組蛋白.經(jīng)Western-

5、Blot分析，該表達(dá)產(chǎn)物能與PRRSV陽(yáng)性血清反應(yīng)，具有良好的反應(yīng)原性，說(shuō)明PRRSV N蛋白在原核系統(tǒng)中獲得了有效表達(dá).
　　 3 PRRSV N蛋白間接ELISA檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用
　　 用純化的N蛋白作包被抗原，通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)條件，建立了檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體的間接ELISA方法.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:抗原的最適包被濃度為2.23μg/mL，血清最適稀釋度為1∶200，最佳血清反應(yīng)時(shí)間確定為37℃1h，二抗反應(yīng)時(shí)間