豬繁殖與呼吸綜合征熒光定量PCR檢測方法建立及其應(yīng)用.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）以母豬發(fā)熱、厭食、流產(chǎn)、死胎、產(chǎn)木乃伊胎和弱仔等繁殖障礙以及仔豬的呼吸道癥狀和高死亡率為特征，由豬繁殖與呼吸綜合征病毒引起，給全球養(yǎng)豬業(yè)造成相當(dāng)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，目前對于本病尚無有效的藥物進(jìn)行治療，主要依靠疫苗預(yù)防接種。因此利用體外增殖該病毒及研究其在豬體內(nèi)的增殖規(guī)律顯的尤為重要。本研究建立了檢測與診斷豬繁殖與呼吸綜合征PCR方法及同時研究在Marc-145細(xì)胞中的增殖規(guī)律和在豬體內(nèi)的增殖規(guī)律及分布，旨在為P

2、RRSV的流行病學(xué)、疫病預(yù)防等相關(guān)領(lǐng)域的研究提供依據(jù)。主要研究內(nèi)容如下： （一）設(shè)計并合成一對特異性引物，通過從病料中提取總RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物純化后與pGEM-T-easy載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，篩選后得到重組標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒，作為模板，且對反應(yīng)的退火溫度、引物濃度等進(jìn)行優(yōu)化，然后以優(yōu)化的條件建立一種能夠快速、靈敏地檢測PRRSV的SYBR-Green1實時熒光定量PCR診斷方法。結(jié)果顯示Ct值與標(biāo)準(zhǔn)

3、品濃度的對數(shù)之間存在良好的線性關(guān)系，線性范圍廣，17～36個循環(huán)都能測出；穩(wěn)定性、重復(fù)性好。用該方法對3份不同的組織樣品進(jìn)行了重復(fù)檢測，結(jié)果表明，該方法具有良好的重復(fù)性，可滿足當(dāng)前PRRS的診斷需要. （二）豬繁殖與呼吸綜合征病毒，可以在原代豬肺泡巨噬細(xì)胞（PAM）、CL2621細(xì)胞系及Marc-145細(xì)胞系上生長繁殖，但引起細(xì)胞病變不明顯，對于其增殖規(guī)律不甚了解。本試驗采用實時熒光定量PCR技術(shù)，研究豬繁殖與呼吸綜合征病毒在M

4、arc-145細(xì)胞中的增殖規(guī)律；結(jié)果顯示病毒在接種后12h開始大量增殖，在18-36h增殖最為迅速，在36-48h達(dá)到病毒增殖最高峰；該結(jié)果為疫苗生產(chǎn)提供了試驗基礎(chǔ)，同時也為研究豬繁殖與呼吸綜合征病毒病理學(xué)研究提供了試驗基礎(chǔ)。 （三）豬繁殖與呼吸綜合征感染的特點之一是持續(xù)性感染和病毒血癥。本研究應(yīng)用建立的熒光定量PCR（FQ-PCR）檢測PRRSV的方法，檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）弱毒疫苗人工感染斷奶前后的仔豬后備