豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體捕獲ELISA檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）主要引起妊娠母豬的繁殖障礙和各年齡段豬群的呼吸系統(tǒng)疾病，尤其是哺乳仔豬。該病自20世紀(jì)80年代發(fā)生以來，已成為危害世界養(yǎng)豬業(yè)最重要的傳染性疾病之一。我國(guó)于1995年首次爆發(fā)PRRS，并于次年分離到病原，證實(shí)我國(guó)存在豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syn

2、drome virus，PRRSV）。
　　 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)具有操作簡(jiǎn)便，易于標(biāo)準(zhǔn)化，便于推廣等優(yōu)點(diǎn)。本研究利用抗GST融合蛋白單克隆抗體，建立抗體捕獲ELISA方法用于PRRSV陰性、陽(yáng)性血清檢測(cè)。利用單克隆抗體特異性高的優(yōu)點(diǎn)，有望建立高特異性、敏感性和可重復(fù)性的抗體檢測(cè)方法，且建立的ELISA檢測(cè)方法可借鑒用于其他病原血清樣品的檢測(cè)，且建立的ELISA檢測(cè)方法可借鑒用于其他病原血清樣品的檢測(cè)。
　　

3、1.GST融合蛋白的原核表達(dá)
　　 設(shè)計(jì)特異性引物，以pGEX-KG空載體為模板PCR擴(kuò)增獲得GST標(biāo)簽序列，克隆到原核表達(dá)載體pET-28a上，獲得重組表達(dá)質(zhì)粒。將獲得的原核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，SDS-PAGE檢測(cè)證實(shí)與His標(biāo)簽融合表達(dá)的GST蛋白主要以包涵體形式存在，且在誘導(dǎo)后5h表達(dá)量達(dá)到最高，融合蛋白大小約為32kDa。
　　 2.抗GST單抗的制備及驗(yàn)證
　　 大量表達(dá)并純化融合蛋

4、白，用純化的融合蛋白免疫雌性BALB/C小鼠，二免后檢測(cè)小鼠血清ELISA抗體效價(jià)，當(dāng)效價(jià)達(dá)到1∶10000以上時(shí)進(jìn)行細(xì)胞融合，經(jīng)間接ELISA篩選和有限稀釋法克隆后獲得8株能穩(wěn)定分泌針對(duì)單一抗原表位抗體的細(xì)胞株。進(jìn)一步經(jīng)Western Blot檢測(cè)證實(shí)所獲得的單抗均能與表達(dá)的GST蛋白及與GST融合的PRRSV N蛋白(GST-N)發(fā)生特異性反應(yīng)。將單抗細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)后接種雌性BALB/C小鼠誘生腹水，收獲的腹水效價(jià)均在1∶500*2

5、5以上，可用于后續(xù)檢測(cè)方法的建立。
　　 3.PRRSV抗體捕獲ELISA檢測(cè)方法的建立
　　 將獲得的抗GST標(biāo)簽的單抗純化后分別包被酶標(biāo)板，再加入純化的融合蛋白GST-N，建立ELISA方法檢測(cè)PRRSV抗體陽(yáng)性和陰性血清樣品。實(shí)驗(yàn)證實(shí)以單抗G2E1株包被酶標(biāo)板同GST-N融合蛋白反應(yīng)有最好的特異性和敏感性，因此確定以單抗G2E1株作為包被抗體建立ELISA檢測(cè)方法。經(jīng)十字交叉法確定抗體最佳包被濃度為1μg/mL，G

6、ST-N蛋白最佳結(jié)合濃度為2μg/mL;血清最佳稀釋倍數(shù)為1∶80，最佳反應(yīng)時(shí)間為30min;二抗最佳工作濃度為1∶3000，最佳反應(yīng)時(shí)間為30min;底物最佳作用時(shí)間為10min。檢測(cè)100份PRRSV抗體陰性血清樣品后確定陰陽(yáng)性臨界值確定為0.31。
　　 4.PRRSV抗體捕獲ELISA檢測(cè)方法的應(yīng)用
　　 以建立的抗體捕獲ELISA方法檢測(cè)727份臨床樣品，同時(shí)與IDEXX HerdChekPRRS ELISA