豬繁殖與呼吸綜合征病毒MN基因的原核表達探索及M-ELISA診斷方法的建立.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，PRRSV)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新病毒，引起豬的繁殖和呼吸系統(tǒng)綜合征。該病以母豬發(fā)熱、厭食和流產(chǎn)、木乃伊胎、弱仔等繁殖障礙以及仔豬的呼吸道癥狀和高死亡率為特征。PRRSV是目前養(yǎng)豬業(yè)中一種嚴重的病毒性傳染病，本病自九十年代中期在我國發(fā)現(xiàn)以來，現(xiàn)已在全國呈蔓延趨勢，所以對PRRSV的檢測及預防尤為重要，建立一種快速高效的診斷

2、方法對于PPRSV的控制具有重大的意義。 用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和PstⅠ對重組質(zhì)粒pMD18-T-MN進行雙酶切，回收獲取MN基因片段后將其亞克隆至pBV220原核表達載體上；重組表達質(zhì)粒用PvuⅡ進行單酶切鑒定，EcoRⅠ和PstⅠ進行雙酶切鑒定；經(jīng)酶切初步鑒定后，送寶生物工程(大連)有限公司測序，將其序列與pMD18-T-MN上MN基因序列進行比對，未發(fā)生堿基突變。由此可知，本試驗成功構建了重組表達質(zhì)粒pBVMN。將重組

3、表達質(zhì)粒pBVMN轉(zhuǎn)化宿主菌DH5α，重組表達質(zhì)粒菌經(jīng)30℃活化過夜后，1∶50稀釋到LB培養(yǎng)基增殖培養(yǎng)，待濃度達到OD600=0.2～0.4時，迅速升溫至42℃誘導4～6h，收集細菌，裂解后經(jīng)SDS-PAGE可檢測到一條分子量約為19kd的目的蛋白條帶，經(jīng)蛋白質(zhì)分析軟件Bandscan分析，其表達量可達19.1％；Western-Blotting分析結果表明該重組蛋白可被兔抗PRRSV血清所識別，與預期的M基因表達產(chǎn)物相一致，而N基因

4、的表達產(chǎn)物未檢測到。將重組表達質(zhì)粒菌進行溫度敏感誘導表達，之后對表達的重組M蛋白進行純化用作包被抗原，建立了檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體的間接ELISA方法，并確立了ELISA最佳工作條件：抗原包被濃度為3.5μg/ml，37℃1h，4℃過夜，血清(1∶40)和酶標SPA(1∶80)分別在37℃溫育1h，加底物溶液常溫顯色5分鐘后觀察結果。經(jīng)重復性試驗、交叉試驗、阻斷試驗等試驗，結果表明該方法重復性好、特異性強、敏感度高；將建立的M-