共表達豬繁殖與呼吸綜合征病毒E、M和N基因重組腺病毒的構建.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)義稱為豬的藍耳病,是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的一種高度接觸性傳染病,該病傳播迅速,臨床癥狀表現(xiàn)為母豬晚期早產(chǎn)、流產(chǎn)、死胎、術乃伊胎,仔豬存活率下降利育成豬的呼吸道疾病等。PRRSV基因組全長約為15kb,有8個讀碼框。ORF2、ORF3和ORF4分別編碼病毒的次要結構蛋白GP2、GP3和GP4,OR

2、F5、ORF6和ORF7分別編碼病毒的主要結構蛋白E蛋白、M蛋白和N蛋白。E、M和N蛋白具有較好的免疫原性,是構成PRRSV的主要抗原。PRRSV在全世界范圍內(nèi)廣泛流行,造成了重大的經(jīng)濟損失,嚴重危害了養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。各國學者紛紛研制各種疫苗,來控制PRRSV的蔓延,腺病毒載體因其自身的優(yōu)越性,由此受到廣泛的關注和應用。
　　 本試驗利用復制缺陷型腺病毒載體首次成功構建了共表達PRRSV囊膜蛋白(EP)、基質蛋白(MP)和核蛋白(

3、NP)的重組腺病毒。在構建重組腺病毒的試驗中,首先用反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)的方法分別擴增出PRRSV的E基因、M基因和N基因,經(jīng)測序正確后將三者用具有自裂解功能的口蹄疫病毒2A多肽的核苷酸序列依次串聯(lián)起來,然后將連接好的E-2A-M-2A-N核苷酸序列克隆入腺病毒穿梭載體pAdTrack-CMV,經(jīng)PCR鑒定和酶切鑒定后篩選出了重組質粒pAdTrack-CMV／E-2A-M-2A-N,將此重組質粒和腺病毒骨架載體pAdEas

4、y-1在大腸桿菌BJ5183內(nèi)進行同源重組,獲得了含有外源基因的重組腺病毒質粒pAd／E-2A-M-2A-N;最后將重組腺病毒質粒經(jīng)PacⅠ酶切線性化后轉染HEK-293細胞,得到含有E-2A-M-2A-N基因的重組腺病毒。對重組腺病毒進行傳代培養(yǎng),之后提取4、6、8、10代病毒的基因組進行PCR擴增,證實外源基因在重組腺病毒中能夠穩(wěn)定遺傳。最后,用蝕斑測定和TCID50的方法來檢測病毒的毒價。本試驗為研制共表達豬繁殖與呼吸綜合征病毒E