豬繁殖與呼吸綜合征病毒抑制IFn-β表達(dá)機(jī)制的探索.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)世界各國流行，是養(yǎng)豬業(yè)危害最嚴(yán)重的疾病之一。其病原豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）屬于套式病毒目（Nidovirales）動(dòng)脈炎病毒科（Arteriviridae）成員之一，基因組為單股正鏈RNA，至少具有10

2、個(gè)ORFs，即ORF1a、ORF1b、ORF2a、ORF2b、ORF3-7，及ORF5a基因。ORF1編碼所有非結(jié)構(gòu)蛋白，已知有14個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白NSP1α、Nsp1β、Nsp2-6、Nsp7α、Nsp7β、Nsp8-12。PRRSV變異、高致病毒株的出現(xiàn)與病毒引起的宿主免疫抑制及繼發(fā)感染是PRRS的主要特征。雖然近年來國內(nèi)外對(duì)該病毒致病機(jī)制研究取得了進(jìn)展，但誘導(dǎo)免疫抑制的機(jī)理還有許多不解之謎。Nsp2是PRRSV編碼的多功能蛋白，包括半

3、胱氨酸酶區(qū)、高變區(qū)、跨膜區(qū)。Nsp2在調(diào)節(jié)宿主的先天性免疫應(yīng)答與PRRSV致病過程中具有重要作用，但其結(jié)構(gòu)和功能還有很多未知的方面。本研究旨在探明浙江地區(qū)近年P(guān)RRSV分離株的變異，初步解明PRRSV病毒感染細(xì)胞內(nèi)Nsp2的分布定位、對(duì)IFN-β表達(dá)的影響及其可能的途徑。
　　 本研究對(duì)2008-2012年間浙江地區(qū)流行的PRRSV毒株Nsp2、GP5、N基因序列進(jìn)行了克隆與遺傳演化分析。結(jié)果顯示，流行毒株與與我國最早的分離的北

4、美型毒株CH1a距離較近。PRRSV流行毒株中有22株Nsp2存在不連續(xù)的30個(gè)氨基酸缺失，占總毒株的38.6％(22/57)。流行毒株GP5在誘騙表位第29位、糖基化位點(diǎn)第34位、在胞外區(qū)第58、59位氨基酸處存在多種形式的氨基酸替換，GP5基因在進(jìn)化過程中存在很高的變異性。N基因系統(tǒng)進(jìn)化樹將流行毒株分為3群(亞群Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)，少數(shù)氨基酸發(fā)生了替換。以上結(jié)果說明中國華東地區(qū)流行毒株以北美型為主，Nsp2、GP5、N基因存在廣泛的變異與

5、多樣性。
　　 重組真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Marc-145與HEK293細(xì)胞后，Nsp2蛋白均表達(dá)在細(xì)胞漿中;免疫印跡檢測(cè)到約120與50kDa的Nsp2蛋白條帶。PRRSV感染Marc-145細(xì)胞4h即可檢測(cè)到Nsp2的表達(dá)，主要定位于細(xì)胞核周圍，隨著感染時(shí)間延長Nsp2分布范圍逐漸擴(kuò)大至整個(gè)細(xì)胞漿;病毒感染后8h，可檢測(cè)到120kDa左右的Nsp2蛋白條帶;感染12 h后可檢測(cè)到70和50kDa左右的Nsp2蛋白，這些蛋白的表達(dá)量

6、隨著感染時(shí)間的延長(24-36 h)顯著增多。以上結(jié)果說明Nsp2是病毒復(fù)制過程中產(chǎn)生的早期病毒蛋白，在復(fù)制過程中產(chǎn)生不同亞型的Nsp2，這些亞型Nsp2在PRRSV致病過程中的具體作用還有待更進(jìn)一步研究。
　　 RNA結(jié)合蛋白LSm14A是新發(fā)現(xiàn)的重要細(xì)胞抗病毒信號(hào)分子，能識(shí)別病毒雙鏈RNA激活細(xì)胞內(nèi)Ⅰ型IFN信號(hào)通路。PRRSV能夠通過多種策略逃逸宿主的先天性免疫，抑制IFN-β的表達(dá)。本研究構(gòu)建了豬源LSm14A分子的真核

7、表達(dá)質(zhì)粒，通過免疫印跡、激光共聚焦、雙熒光報(bào)告系統(tǒng)、熒光定量等方法分析豬源LSm14A分子的天然免疫活性。結(jié)果表明:LSm14A在豬的不同組織中廣泛表達(dá);在HEK293與Marc-145細(xì)胞上過量表達(dá)LSm14A能顯著激活I(lǐng)FN-β、NF-κB啟動(dòng)子，并且呈劑量依賴式協(xié)同poly(I∶C)激活I(lǐng)FN-β啟動(dòng)子;PRRSV感染顯著抑制外源LSm14A分子誘導(dǎo)的IFN-β啟動(dòng)子的活性;以上結(jié)果說明，LSm14A分子能夠誘導(dǎo)IFN-β的表達(dá)，

8、而PRRSV對(duì)這一效應(yīng)可能具有拮抗作用。
　　 本研究建立了一株穩(wěn)定表達(dá)Nsp2的細(xì)胞株11C1-HEK293，并且構(gòu)建了Ⅰ型干擾素信號(hào)通路中的重要信號(hào)分子MAVS真核表達(dá)質(zhì)粒。利用雙熒光報(bào)告基因、熒光定量、免疫印跡與免疫熒光等方法，對(duì)Nsp2在調(diào)節(jié)Ⅰ型干擾素反應(yīng)方面進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，信號(hào)分子MAVS能明顯激活I(lǐng)FN-β啟動(dòng)子活性，促進(jìn)IFN-βmRNA產(chǎn)生;病毒Nsp2能顯著抑制poly(Ⅰ∶C)與信號(hào)分子MAVS、LSm

9、14A誘導(dǎo)的IFN-β啟動(dòng)子活性與mRNA的轉(zhuǎn)錄;雖然我們初步觀察到Nsp2與MAVS、LSm14A存在共定位現(xiàn)象，但免疫熒光顯示Nsp2不影響IRF3或NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核。因此，我們推測(cè)PRRSV逃逸宿主先天免疫的途徑可能在細(xì)胞核內(nèi)，可能通過影響IFN-β轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物的活性發(fā)揮其抗IFN-β作用。
　　 綜上所述，豬源LSm14A具有激活I(lǐng)FN-β啟動(dòng)子活性，上調(diào)IFN-β mRNA水平，而PRRSV感染可以顯著抑制pol