shRNA抑制豬繁殖與呼吸綜合征病毒在Marc145細(xì)胞中復(fù)制的研究.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respi ratory syndromevirus，PRRSV)屬于尼多病毒目動(dòng)脈炎病毒科，它主要引起母豬早產(chǎn)、流產(chǎn)等繁殖障礙，仔豬、育肥豬呼吸困難及育成豬類流感疾病，此外該病毒持續(xù)性感染，可引起免疫抑制，成為危害世界養(yǎng)豬業(yè)安全的重要病原之一。然而，目前疫苗的使用只能夠提供部分保護(hù)使機(jī)體不再出現(xiàn)臨床癥狀，不能夠阻止感染，因此，迫切需要開發(fā)一種新型的、能對(duì)所有PR

2、RSV病毒株提供保護(hù)的抗病毒措施。 RNA干擾是由雙鏈RNA(dsRNA)引發(fā)的信使RNA(mRNA)序列特異性消減現(xiàn)象，是一種保守的抗病毒機(jī)制，已發(fā)現(xiàn)于線蟲、植物和哺乳動(dòng)物中。將21～2 3nt的小分子干擾RNA雙鏈(sma ll interfererlce RNA，s iRNA)或載體DNA轉(zhuǎn)錄的發(fā)夾RNA (shor thairpin RNAs，shRNAs)導(dǎo)入細(xì)胞，可以抑制同源的內(nèi)源或病原mRNA的表達(dá)。近幾年，RN

3、Ai技術(shù)已被用于干擾HBV、HCV、流感和其他人類病毒的感染研究，提示RNAi作為一個(gè)有效的抗病毒策略，具有很大應(yīng)用前景，但是目前對(duì)于PRRSV是否存在RNA干擾現(xiàn)象，究竟哪些基因哪些序列是合適的靶標(biāo)，shRNA對(duì)PRRsV抑制有哪些特征等等，尚沒有這方面的研究。 為了探討psUPER質(zhì)粒能否有效表達(dá)發(fā)夾小干擾RNA(shRNA)，作為RNAi研究的平臺(tái)，本研究利用RNA干擾技術(shù)，以A型流感病毒核衣殼蛋白(NP)基因?yàn)榘谢?，選

4、用已知的有高效抑制效果的siRNA片段，設(shè)計(jì)有小發(fā)夾結(jié)構(gòu)的兩條寡核苷酸序列，經(jīng)退火成互補(bǔ)雙鏈，再克隆至質(zhì)粒pSUPER中，經(jīng)酶切鑒定和測(cè)序證實(shí)表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功，命名為pSUPER-NP。將該表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染雞胚成纖維細(xì)胞(cEF)，24h后用A型流感病毒感染，病毒感染40h后觀察細(xì)胞病變，測(cè)定病毒血凝效價(jià)和TCID<,50>，發(fā)現(xiàn)psUPER-NP能夠阻止細(xì)胞病變的出現(xiàn)，pSUPER-NP轉(zhuǎn)染孔的血凝價(jià)和TcID<,50>均顯著下降，表明該

5、表達(dá)質(zhì)粒能抑制流感病毒的復(fù)制，pSUPER質(zhì)?？梢詰?yīng)用于哺乳動(dòng)物高效的RNAi研究，也為探索流感病毒致病機(jī)理和開發(fā)基因治療新途徑奠定了基礎(chǔ)。 RNAi抑制效果的正確評(píng)價(jià)，需要合適的檢測(cè)方法，為了建立靈敏、快速的mRNA檢測(cè)方法，本研究設(shè)計(jì)合成了一套引物和TaqMan探針，以擴(kuò)增豬繁殖與呼吸綜合征病毒的核衣殼蛋白基因，通過反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立了快速定量檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合征病毒的實(shí)時(shí)PCR方法，并用該法檢測(cè)患病豬的肺臟等樣品。結(jié)果

6、表明該方法具有較好的特異性和重復(fù)性，對(duì)PRRsV細(xì)胞培養(yǎng)物的檢測(cè)下限為0.01TcID<,50>，敏感性比常規(guī)RT-PCR高100倍；對(duì)10份PRRS疑似豬肺臟樣品檢測(cè)5份為陽性，與病毒分離的陽性符合率為100％。該方法具有快速、靈敏、準(zhǔn)確、低污染等優(yōu)點(diǎn)，在PRRSV的早期檢測(cè)、預(yù)防控制、進(jìn)出口檢疫及基礎(chǔ)研究中會(huì)起到重要作用。轉(zhuǎn)染效率低是阻礙siRNA介導(dǎo)的基因沉默效果的重要因素，為了實(shí)現(xiàn)質(zhì)粒在Marc145細(xì)胞中的最佳轉(zhuǎn)染，本研究以熒

7、光質(zhì)粒pEGFP為報(bào)告質(zhì)粒，通過對(duì)轉(zhuǎn)染試劑的選擇、脂質(zhì)體質(zhì)粒比例、細(xì)胞密度和最佳質(zhì)粒轉(zhuǎn)染量的優(yōu)化，確定了質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Marc145細(xì)胞的最佳轉(zhuǎn)染條件，即轉(zhuǎn)染前24h將96孔板每孔鋪10><'4>個(gè)細(xì)胞，轉(zhuǎn)染前4h將細(xì)胞換液，轉(zhuǎn)染時(shí)TransFast<'TM> Transfection Reagent與質(zhì)粒比(μL／μg)為3:1，每孔轉(zhuǎn)染0.4μg的pEGFP(24孔板每孔1.0μg)時(shí)，轉(zhuǎn)染孔的熒光數(shù)最多，熒光強(qiáng)度最大，轉(zhuǎn)染效率最高，從而

8、為下一步的shRNA表達(dá)質(zhì)粒高效轉(zhuǎn)染Marc145細(xì)胞奠定了基礎(chǔ)。 不同基因不同區(qū)域上的siRNA抑制基因表達(dá)的能力差異很大，為了篩選PRRSV基因組上功能性的shRNA分子，本研究利用Ambion公司的在線設(shè)計(jì)工具h(yuǎn)ttD：www．a(chǎn)mbion．com／techlib／misc／siRNA design html，根據(jù)siRNA設(shè)計(jì)原則，選擇了針對(duì)PRRSV S1株P(guān)A、GP5、M、N基因及5’UTR序列的14個(gè)siRNA靶序

9、列，經(jīng)BLAST驗(yàn)證，所選擇的靶序列與豬體和其他病毒基因片段無同源性。根據(jù)pSUPER載體要求，合成了14對(duì)互補(bǔ)的寡核苷酸，寡核苷酸的結(jié)構(gòu)為：5’端19個(gè)核苷酸為siRNA的正義鏈，中間加入9個(gè)核苷酸TTCAAGAGA間隔以形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，19個(gè)核苷酸siRNA的反義鏈，3’端加有轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)TTTTT。并且正義鏈寡核苷酸5’端帶有Bg1Ⅱ(GATC)酶切位點(diǎn)粘性末端，反義鏈寡核苷酸5’端帶有Xho Ⅰ(TCGA)酶切位點(diǎn)粘性末端。將各對(duì)

10、寡核苷酸分別退火，克隆到pSUPER載體上。經(jīng)EeoR I／Kpn I雙酶切鑒定和測(cè)序鑒定后，證明已成功構(gòu)建了針對(duì)相應(yīng)基因不同區(qū)域的shRNA(small hairPin RNA)表達(dá)質(zhì)粒。為進(jìn)一步進(jìn)行RNA干擾試驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。 為了驗(yàn)證上述構(gòu)建的shRNA表達(dá)質(zhì)粒表達(dá)的shRNA對(duì)靶基因表達(dá)的抑制，本研究首先根據(jù)PRRSV S1株病毒基因組序列設(shè)計(jì)5對(duì)特異性引物，分別擴(kuò)增GP5、M、N基因及PA和5’UTR部分序列，經(jīng)Hind

11、Ⅲ／BamH I克隆到pEGFP-N1載體，構(gòu)建了5個(gè)EGFP融合表達(dá)質(zhì)粒。將融合表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293A細(xì)胞，分別在24h，48h，72h觀察熒光的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)各蛋白均得到了表達(dá)，轉(zhuǎn)染后24h就可見到熒光，48h熒光增強(qiáng)，72h最強(qiáng)，然后逐漸減弱；p1b-EGFP-N1、pUTR-EGFP-N1、pGP5-EGFP-N1表達(dá)的蛋白主要在胞漿，呈彌散狀充盈整個(gè)細(xì)胞；而pN-EGFP-N1轉(zhuǎn)染的孔熒光主要在胞漿和胞核；pM-EGFP-

12、N1表達(dá)的蛋白24h在胞漿和核周區(qū)，呈圓圈狀，有的在核周兩極濃染，48h-72h主要集中在胞漿和核仁。將shRNA表達(dá)質(zhì)粒與構(gòu)建的融合表達(dá)質(zhì)粒分別兩兩共轉(zhuǎn)染HEK293A細(xì)胞，分別在轉(zhuǎn)染后48h觀察熒光的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，shRNA質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞的孔熒光均有不同程度的減弱，熒光細(xì)胞數(shù)減少，其中pSUPER-N3、pSUPER-G1、pSUPER-G2、pSUPER-M2、pSUPER-M3、pSUPER-P2、pSUPER-P3質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染

13、的孔熒光減少得較為明顯。將shRNA表達(dá)質(zhì)粒與表達(dá)PRRSV結(jié)構(gòu)蛋白GP5、M和N的pCDNA3真核表達(dá)質(zhì)粒分別兩兩共轉(zhuǎn)染HEK293A細(xì)胞，通過半定量PCR檢測(cè)在mRNA水平上來驗(yàn)證這些shRNA表達(dá)載體對(duì)結(jié)構(gòu)基因表達(dá)的抑制，結(jié)果表明GP5、M和N蛋白基因shRNA表達(dá)載體對(duì)其各自蛋白的抑制率為36％-69％，其中pSUPER-N3和pSUPER-GI抑制效果最為顯著。為了探討上述有顯著抑制效果的shRNh對(duì)PRRSV復(fù)制的抑制作用，

14、本研究將7個(gè)靶向PRRSV基因組中的GP5和N蛋白基因shRNA表達(dá)質(zhì)粒和pSUPER轉(zhuǎn)染Marcl45細(xì)胞，研究靶向PRRSV基因組中的GP5和N蛋白基因的shRNA抑制PRRSV在Marcl45細(xì)胞中復(fù)制的情況。結(jié)果表明shRNA表達(dá)質(zhì)粒表達(dá)的shRNA在PRRSV感染后48h對(duì)病毒復(fù)制的抑制達(dá)到10-1000倍，其中pSUPER-N3、pSUPER-G1的抑制效果最為明顯，將這兩種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染Marc145細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)能夠提高shRN

15、A對(duì)病毒的抑制作用，表明shRNA表達(dá)質(zhì)粒對(duì)病毒復(fù)制的抑制作用具有相加性，而且這種抑制作用能持續(xù)到感染后4d。通過對(duì)SiRNA點(diǎn)突變，構(gòu)建了靶向同一序列的突變體shRNA表達(dá)質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)染Marcl45細(xì)胞，病毒的復(fù)制不受其影響，表明這種抑制作用序列特異性。將不同劑量的pSUPER-N3或pSUPER-G1轉(zhuǎn)染Marcl45細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)隨著劑量的增加shRNA對(duì)病毒復(fù)制的抑制作用也有所增強(qiáng)，呈現(xiàn)出劑量依賴性抑制，而且用shRNA表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)

16、染已經(jīng)感染PRRSV的Marcl45細(xì)胞，病毒的復(fù)制也得到了抑制，這些研究表明靶向PRRSV基因組不同區(qū)域的siRNA可以作為控制該病毒傳播的候選策略。本研究也觀察了靶向PRRSV基因組5'UTR及PA、M基因的siRNA抑制PRRSV在Marc145細(xì)胞中的復(fù)制，以進(jìn)一步篩選PRRSV基因組5'UTR及PA、M基因上的功能性shRNA。將shRNA表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Marcl45細(xì)胞，24h后用PRRSV感染，病毒感染后48h通過間接免疫熒