豬繁殖與呼吸綜合征病毒引起MARC-145細(xì)胞產(chǎn)生自噬對(duì)病毒復(fù)制的影響及其信號(hào)通路研究.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，PRRSV)引起以妊娠母豬繁殖障礙以及仔豬和生長(zhǎng)育肥豬呼吸道癥狀和高死亡率為特征的豬繁殖與呼吸綜合征(Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome，PRRS)，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。盡管對(duì)PRRSV致病機(jī)制進(jìn)行了廣泛的研究，取得了一系列有重要意義的成果，但在病毒的感染機(jī)制

2、及與宿主細(xì)胞的相互作用機(jī)制等方面，人們還知之甚少，是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。本研究主要針對(duì)PRRSV感染后誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生自噬反應(yīng)的分子機(jī)制進(jìn)行了深入探討，系統(tǒng)分析了PRRSV與細(xì)胞自噬的相互作用機(jī)制。主要研究?jī)?nèi)容包括:
　　1.PRRSV感染引起MARC-145細(xì)胞產(chǎn)生自噬現(xiàn)象
　　應(yīng)用透射電子顯微技術(shù)、共聚焦免疫熒光技術(shù)，免疫印跡(WesternBlot)分析，對(duì)感染PRRSV的細(xì)胞的自噬水平進(jìn)行定性和定量分析。透射電鏡可以觀察到

3、感染PRRSV的細(xì)胞胞漿近核區(qū)雙膜自噬體樣結(jié)構(gòu)顯著增多;感染PRRSV的細(xì)胞內(nèi)LC3呈點(diǎn)狀分布，且與PRRSV非結(jié)構(gòu)蛋白NSP2共定位，表明自噬可能參與到PRRSV的復(fù)制;WesternBlot檢測(cè)到細(xì)胞內(nèi)LC3-Ⅱ分子的水平隨著病毒復(fù)制不斷增加;結(jié)果表明，PRRSV感染可以誘導(dǎo)MARC-145細(xì)胞產(chǎn)生自噬。而紫外線UV滅活的病毒不能引起細(xì)胞自噬的活化。這些結(jié)果表明，PRRSV的感染復(fù)制與細(xì)胞自噬密切相關(guān)。
　　2.細(xì)胞自噬影響P

4、RRSV的復(fù)制
　　我們通過(guò)自噬藥物調(diào)節(jié)劑及shRNAs干擾技術(shù)，改變MARC-145細(xì)胞的自噬活性，再感染PRRSV，測(cè)定PRRSV滴度，檢測(cè)分析細(xì)胞自噬對(duì)病毒復(fù)制的影響。結(jié)果表明，自噬誘導(dǎo)劑rapamycin可以提高M(jìn)ARC-145細(xì)胞自噬水平，細(xì)胞內(nèi)N蛋白的表達(dá)量及細(xì)胞上清子代病毒的滴度明顯增加;相反，利用自噬抑制劑3-MA降低細(xì)胞自噬水平后，MARC-145細(xì)胞內(nèi)病毒N蛋白的表達(dá)量及細(xì)胞上清子代病毒的滴度顯著降低。同樣，干

5、擾自噬基因ATG5和LC3B抑制細(xì)胞自噬，細(xì)胞內(nèi)病毒N蛋白的表達(dá)量及細(xì)胞上清子代病毒量顯著降低。這些結(jié)果表明細(xì)胞自噬可以促進(jìn)PRRSV在MARC-145細(xì)胞的復(fù)制。我們利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了高濃度藥物rapamycin(500nM)和3-MA(20mM)處理對(duì)PRRSV入胞的影響，并檢測(cè)了藥物處理細(xì)胞及自噬基因缺失細(xì)胞其上清乳酸脫氫酶LDH含量變化以檢測(cè)藥物及干擾處理的細(xì)胞毒性。結(jié)果表明，自噬調(diào)節(jié)藥物并不影響細(xì)胞的病毒的入胞;自噬調(diào)節(jié)藥物

6、處理細(xì)胞及自噬基因缺失細(xì)胞其上清乳酸脫氫酶LDH含量與對(duì)照組細(xì)胞沒有明顯變化，表明該處理影響病毒復(fù)制并不是通過(guò)其細(xì)胞毒性及影響病毒入胞。
　　3.細(xì)胞自噬為豬繁殖與呼吸綜合征病毒復(fù)制提供位點(diǎn)
　　確定細(xì)胞自噬可以促進(jìn)病毒復(fù)制的基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步研究了PRRSV引起的自噬體特性，研究發(fā)現(xiàn)在PRRSV誘導(dǎo)產(chǎn)生的自噬體，其標(biāo)志分子LC3不能完全與溶酶體的標(biāo)志分子LAMP1及染料Lysotracker特異性標(biāo)記的溶酶體結(jié)構(gòu)共定位;通

7、過(guò)轉(zhuǎn)染雙熒光質(zhì)粒GFP-RFP-LC3，在PRRSV感染的細(xì)胞內(nèi)雙陽(yáng)性的GFP和RFP蛋白可以共定位，而在沒有感染PRRSV的細(xì)胞內(nèi)則主要為紅色RFP-LC3蛋白為主;溶酶體抑制藥物CQ也沒有進(jìn)一步的改變?nèi)苊阁w對(duì)LC3-Ⅱ蛋白的降解，所有這些結(jié)果表明，PRRSV引起的自噬體與溶酶體的融合受到抑制。病毒蛋白NSP2及dsRNA能夠與自噬體標(biāo)志分子LC3-Ⅱ共定位，說(shuō)明PRRSV復(fù)制復(fù)合體可能利用了自噬體結(jié)構(gòu);通過(guò)密度梯度離心初步分離純化病

8、毒復(fù)制復(fù)合體并進(jìn)行westernblot驗(yàn)證了PRRSV復(fù)制成分與自噬體標(biāo)志分子LC3-Ⅱ及ER標(biāo)志分子PDI的共密度梯度組分，結(jié)果表明，PRRSV感染抑制了自噬體與溶酶體的融合，從而利用自噬體結(jié)構(gòu)作為自身復(fù)制的膜結(jié)構(gòu)，促進(jìn)了病毒的增殖。
　　4.豬繁殖與呼吸綜合征病毒通過(guò)mTOR通路影響自噬
　　自噬體的誘導(dǎo)具有嚴(yán)格的細(xì)胞信號(hào)通路調(diào)控，在本研究中我們首先檢測(cè)了在自噬中具有重要調(diào)節(jié)作用的激酶的變化并通過(guò)藥物特異性抑制信號(hào)通路

9、中各個(gè)激酶活性，研究其在PRRSV感染誘導(dǎo)的MARC-145細(xì)胞自噬中所起的作用。結(jié)果表明，在PRRSV感染的MARC-145細(xì)胞中，mTORC1活性受到抑制導(dǎo)致自噬活化增強(qiáng)，mTOR下游信號(hào)通路蛋白P70S6K和4E-BP1的磷酸化水平降低進(jìn)一步驗(yàn)證了mTORC1活性受到抑制;mTOR上游激酶PI3K抑制劑LY294002和rapamycin可以抑制mTOR的磷酸化而增強(qiáng)細(xì)胞的自噬水平進(jìn)一步表明mTOR在PRRSV誘導(dǎo)引起的自噬中的作

10、用。AMPK在PRRSV感染后磷酸化水平增加，通過(guò)抑制劑CompoundC抑制酶活后，自噬水平?jīng)]有受到影響，說(shuō)明雖然AMPK磷酸化水平的增加在PRRSV誘導(dǎo)引起的自噬中可能不起作用。
　　5.UPR與自噬的關(guān)系研究
　　病毒感染引起的UPR在自噬的誘導(dǎo)發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮重要作用。在本研究中，我們檢測(cè)比較了在PRRSV感染的MARC-145細(xì)胞和ERstress誘導(dǎo)劑衣霉素TU處理細(xì)胞內(nèi)UPR信號(hào)通路PERK、eIF2α及JNK的

11、磷酸化水平及XBP1的剪切，結(jié)果顯示，PRRSV感染分別在4hpi和6hpi引起了PERK通路PERK及其下游eIF2α磷酸化增強(qiáng)，與PRRSV誘導(dǎo)引起的自噬趨勢(shì)一致;XBP1的剪切水平在8hpi開始出現(xiàn)，JNK的磷酸化水平也顯著增加;這些結(jié)果表明，PRRSV可以引起MARC-145細(xì)胞內(nèi)IRE1α/XBP1和PERK兩條UPR信號(hào)通路的活化。通過(guò)對(duì)IRE1α基因進(jìn)行干擾敲除，我們分析了UPR在PRRSV誘導(dǎo)引起的自噬中的作用，結(jié)果表明