豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5蛋白拓撲結構研究.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus，PRRSV)引起的一種以母豬繁殖障礙以及仔豬呼吸道疾病為特征的傳染性疾病。該病自發(fā)現(xiàn)以來給我國的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經濟損失。近幾年來我國大部分地區(qū)夏秋季出現(xiàn)豬的高熱病，農業(yè)部2007年確

2、定引起高熱病的主要病原是豬繁殖與呼吸綜合征病毒變異株。GP5蛋白是PRRSV主要囊膜蛋白之一，也是誘導機體產生免疫反應的主要保護性抗原蛋白。蛋白質結構決定功能，病毒囊膜蛋白拓撲結構研究是一項基礎性工作。PRRSV-GP5拓撲結構的研究，對深入了解PRRSV與宿主細胞相互作用，研制高效PRRS疫苗都具有積極意義。
　　 本文針對高致病性PRRSV(江西a1)，從四個方面對GP5蛋白進行拓撲結構研究，獲得了初步的研究結果。
　

3、　 一、GP5蛋白拓撲結構預測
　　 通過hmmtop、TMHMM-2.0、MemBrain和DAS等軟件分析，GP5蛋白共有三個主要集中疏水片段，分別是Aa8-27、Aa63-82和Aa107-126。推測這三段可能是跨膜片段，GP51-33Aa為信號肽，翻譯后發(fā)生剪切，推測為后兩段為跨膜片段，AB表位和C末端是GP5蛋白的兩個重要抗原表位區(qū)，所以推測30-62位于病毒囊膜的外側，83-106位于病毒囊膜內側，而127以后位

4、于囊膜的內側。
　　 二、GP5蛋白親水區(qū)特異性抗體制備
　　 根據(jù)以上預測結果，分別化學合成GP5蛋白的四個親水區(qū)肽段：MLGKCLTACCCSRLLFLWCIVPFYLAVC(Aa1-27，編號為IL36)、VLVN ASNNNSSHIQLIYNLC(Aa27-45，編號IG45)、TTSHFLDTVGLATVST AGYYHGRYC(Aa83-106，編號為IY45)和TPLTRVSAELWGRL(Aa187-20

5、0，編號為IL-35)。將合成肽用白油佐劑乳化后，免疫ICR小白鼠，ELISA檢測血清效價并驗證特異性，最后采血分離血清備用。
　　 三、免疫學方法研究GP5蛋白拓撲結構
　　 應用免疫學方法研究GP5蛋白在細胞中和病毒粒子中的拓撲結構。將PRRSV接種Marc-145細胞，細胞固定后，利用不同去垢劑處理(Tritonx-100和digitonin)，進行間接免疫熒光實驗，結果顯示AB表位和C末端兩個重要抗原表位區(qū)位于細

6、胞內質網(wǎng)腔的內側(lumen)，即病毒囊膜的外側。通過超離純化病毒粒子后，使用蛋白酶k水解，進行的western-blotting試驗，結果也表明，AB表位和C端也位于病毒囊膜的外側，與預測結果相符合。
　　 (四)融合蛋白法研究GP5蛋白膜拓撲結構
　　 應用融合蛋白方法，將禽流感血凝素標簽與GP5融合研究GP5膜拓撲結構。利用重疊延伸PCR技術將HA標簽(YPYDVPDYA)分別插入到GP5的N端、50位、95位和C