豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5蛋白假型病毒體系的建立.pdf

1、本試驗利用RT-PCR方法分別克隆豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)河南分離株Hn-1/06 GP5和GP6基因，并進行了遺傳變異分析，結果表明該分離株的核苷酸序列和氨基酸序列與美洲型標準株VR2332的同源性分別為89.6％和89.5％；與國內(nèi)江西分離株J-X0612的同源性分別為97.4％和96.0％。 將GP5、GP6基因克隆入真核表達載體：pcDN.A3.0，分別構建pcDNA-GP5單表達載體、pcDNA-GP5-G

2、P6串聯(lián)表達載體和pcDNA-GP5/6共表達載體，運用磷酸鈣方法分別瞬時轉(zhuǎn)染人胚腎細胞293T，48h后收集細胞，與抗PRRSV特異性血清及熒光素標記羊抗豬二抗反應，用流式細胞儀檢測，GP5蛋白在2933T細胞表面獲得表達，共表達重組質(zhì)粒的GP5蛋白熒光標記細胞數(shù)達到48.5％；單一GP5重組質(zhì)粒的GP5蛋白熒光標記細胞數(shù)達到33％；串聯(lián)表達重組質(zhì)粒的GP5蛋白表達標記細胞數(shù)很少，僅為7.3％。該試驗結果說明PRRSV GP5蛋白和M

3、蛋白異源二聚體的形成是對GP5蛋白的轉(zhuǎn)運、定位是有影響的。 將構建好的pcDNA-GP5、pcDNA-GP5/6重組質(zhì)粒分別與鼠自血病病毒(MuLV)病毒假型構建體系的兩種質(zhì)粒pHIT60(包括MuLV的結構蛋白基因，即gag和pol和pHI111(為MuLV的基因組及報告基因LacZ)瞬時共轉(zhuǎn)染人胚腎細胞293T,48b后收獲PRRS病毒假型粒子，超速離心濃縮病毒粒子，SDS-PAGE電泳，與抗GP5特異性血清及辣根過氧化物酶

4、標記二抗反應，Western blot證實GP5蛋白在病毒假型顆粒表面表達，GP5蛋白整合到病毒假型粒子表面。將病毒假型粒子感染Marc-145和豬肺巨噬細胞(PAM)等不同的靶細胞,48h后檢測報告基因，證實所構建的病毒假型粒子有感染性，確定GP5基因編碼蛋白與病毒感染有關的糖蛋白抗原；同時發(fā)現(xiàn)由M蛋白介導GP5蛋白假型病毒顆粒的感染低度比單一GP5蛋白假型病毒顆粒感染低度高。 本研究通過Western blot試驗發(fā)現(xiàn)GP5