豬繁殖與呼吸綜合征病毒結構蛋白抗原表位的分析.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine respiratory and reproductive syndrome virus,PRRSV)引起的一種以母豬繁殖障礙和仔豬呼吸道疾病為特征的傳染病.該研究利用噬菌體展示技術,結合ELISA和基本表達等技術對PRRSV結構蛋白的抗原表位進行了鑒定與分析,為PRRSV的結構蛋白免疫特性與功能研究以及表位疫苗的設計等奠定了基礎.1.運用GoldenKey分子生物學軟件對PR

2、RSV BJ-4結構蛋白的抗原表位及其二級結構進行了分析和比較,從中篩選13段顯示表位特征的氨基酸殘基序列,用PCR技術擴增相應的核苷酸片段,將其插入到噬菌體表達載體M13KE,結構預測的13個表位可在噬菌體表面得以展示.2.利用PRRSV BJ-4陽性血清和鼠源抗重組結構蛋白抗體,采用間接ELISA方法對噬菌體展示的表位進行了鑒定.結果表明,在預測的13個抗原表位中,鑒定出7個表位.GP2a的aa110~aa136(GP2110)可被

3、鼠源抗重組GP2a抗體所識別;GP3的aa81~aa91(GP381)能夠被PRRSV陽性血清和鼠源抗重組GP3抗體識別;GP4的aa53~aa67(GP453)和aa107~aa115(GP4107)可被PRRSV陽性血清和鼠源抗GP4抗體識別;GP5的aa30~aa39(GP530)、aa161~aa169(GP516)和aa190~aa200(GP5190)可被PRRSV陽性血清和鼠源抗重組GP5抗體識別.其中,GP2110、GP

4、453和GP530等3個抗原表位與已報道的抗原表位相似,其余4個抗原表位(GP381、GP4107、GP5161和GP5190)是新確認的PRRSV抗原表位.3.采用噬菌體隨機7肽庫對單克隆抗體GE3識別的抗原表位進行了鑒定.從第三輪親和篩選的噬菌體中隨機挑取17個克隆進行功能鑒定,結果表明8個克隆與mAb GE3具有較強的特異性結合力并可以被PRRSV陽性血清阻斷,測序發(fā)現(xiàn)7個克隆具有核心序列:P/EKPHF,該序列與PRRSV N蛋

5、白aa50~aa55(P/EKPHF)具有較高的同源性.用PRRSV陽性血清和鼠源抗PRRSV抗體采用間接ELISA進行鑒定,結果表明篩選到的噬菌體克隆可以與血清發(fā)生特異性反應,從而初步確定了單克隆抗體GE3所識別的抗原表位.4.將編碼單克隆抗體GE3所識別的抗原表位的核苷酸片段插入到原核表達載體pGEX-4T-2中,實現(xiàn)了GE3所識別的抗原表位在大腸桿菌中的表達.經SDS-PAGE分析表明,表達的GST-融合蛋白與預期大小相答.Wes