豬繁殖與呼吸綜合征病毒2b蛋白互作宿主細(xì)胞蛋白的篩選.pdf

1、2b蛋白由PRRSV的ORF2b所表達(dá)的結(jié)構(gòu)蛋白，又稱為GP2b蛋白，該結(jié)構(gòu)蛋白對PRRSV感染宿主細(xì)胞起著重要作用，本研究通過酵母雙雜交技術(shù)來篩選與PRRSV2b蛋白互作的PAM蛋白，主要研究內(nèi)容包括三個(gè)方面。
　　第一步，構(gòu)建文庫菌株：以15日齡健康仔豬為原材料，分離培養(yǎng)豬肺泡巨噬細(xì)胞（PAM），從PAM中提取總RNA，以總RNA為模板合成cDNA。將擴(kuò)增后的cDNA以同源重組的方式與線性載體pGADT7-Rec進(jìn)行重組，并轉(zhuǎn)

2、化入Y187酵母感受態(tài)中，培養(yǎng)于SD/-Leu平板上。經(jīng)培養(yǎng)后，隨機(jī)挑取若干菌落進(jìn)行PCR檢測后并收獲文庫菌株，經(jīng)文庫滴度檢測，文庫的庫容達(dá)6.69×107 cfu/mL。
　　第二步，釣餌菌株的構(gòu)建：以PRRSV的CH-1R株為原始材料，提取基因組RNA，采用RT-PCR擴(kuò)增2b基因。將2b基因擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)雙酶切后克隆至pGBKT7質(zhì)粒上，構(gòu)建出pGBKT7-2b重組釣餌載體。將釣餌載體轉(zhuǎn)化入Y2H Gold酵母感受態(tài)中，培養(yǎng)于S

3、D/-Trp平板上。經(jīng)自激活檢測和毒性檢測，該釣餌菌株無自激活和毒性現(xiàn)象。提取酵母中的pGBKT7-2b重組載體，經(jīng)酶切后電泳證實(shí)了釣餌菌株的構(gòu)建成功。
　　第三步，互作蛋白的篩選及序列分析：將文庫菌株與釣餌菌株進(jìn)行雜交融合，并將雜交后的酵母培養(yǎng)物涂布于營養(yǎng)雙缺失的DDO/X/A平板上進(jìn)行培養(yǎng)，生長出的藍(lán)色菌落轉(zhuǎn)接至四缺培養(yǎng)基QDO/X/A平板上，并將依然為藍(lán)色菌落進(jìn)行菌落PCR檢測，PCR檢物進(jìn)行測序，將測序后的堿基序列進(jìn)行分析